具有XNA识别及合成活性的Stoffel片段的突变株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了具有XNA识别及合成活性的Stoffel片段的突变株及其应用。Taq DNA聚合酶的Stoffel片段突变株包括SFM5

【技术实现步骤摘要】
具有XNA识别及合成活性的Stoffel片段的突变株及其应用


[0001]本专利技术属于酶分子改造领域，具体涉及具有XNA识别及合成活性的Stoffel片段的突变株及其应用。

技术介绍

[0002]DNA或RNA是所有生物体发育和发挥功能所必需的生物大分子，其作用是存储、检索和传递遗传信息，并且在生物技术和生物医药当中也获得了广泛的应用。然而，DNA和RNA生物化学稳定性较差，大大限制了它们在许多方面的应用。因此，研究人员开发了多种DNA和RNA的类似物，分别在天然核酸的糖环、碱基、磷酸骨架上进行修饰，这些类似物被称为非天然核酸(XNAs)。其中，研究最广泛的是在糖环上修饰的XNA。例如，苏糖核酸(TNA)、己醇核酸(HNA)、环己烯核酸(CeNA)、锁核酸(LNA)、阿拉伯糖核酸(ANA)和2
’‑
氟
‑
阿拉伯糖核酸(FANA)等。其中，核糖或脱氧核糖的2
’
位修饰备受关注，比如2
’‑
叠氮(2
’‑
Az)、2
’‑
氨基(2
’‑
Am)、2
’‑
氟(2
’‑
F)和2
’‑
甲氧基(2
’‑
OMe)修饰。其中，2
’‑
F或2
’‑
OMe修饰的核酸在核酸酶抗性方面有更好的表现。抵抗核酸酶降解的作用使这XNA在基于指数富集配体系统进化(SELEX)方面显示出巨大优势。
[0003]聚合酶对非天然底物的识别和处理与XNA编码和解码信息密切相关。然而，由于较高的底物特异性，天然聚合酶难以高效识别非天然核苷酸。因此，遗传信息在XNA之间的传递，如XNA的转录、逆转录和复制都难以实现。研究人员通过酶工程对聚合酶进行改造使其能够识别和利用非天然核酸。Ellington组进化了一系列Tgo聚合酶的突变株，其能够合成和反转录各种XNA，如HNA、TN A、FANA和ANA等。Chaput组获得的KOD聚合酶突变株RSGA的TNA底物的特异性增强。Romesberg组基于噬菌体展示技术对Stoffel片段进行定向进化，获得了Taq DNA聚合酶的Stoffel片段突变株SFM4
‑
3、SFM4
‑
6和SFM4
‑
9，其中SFM4
‑
3不仅可以合成全2
’‑
OMe修饰的非天然核酸，而且可以通过PCR扩增得到部分2
’‑
OMe或2
’‑
F修饰的核酸链。目前Taq DNA聚合酶的Stoffel片段突变株(以下简称Stoffel片段突变株)在识别和合成更长的全2
’‑
OMe修饰的非天然核酸的活性上仍有不足，现在通过饱和突变筛选获得能够合成长片段全2
’‑
O Me修饰核酸，以及以RNA或全修饰XNA为模板合成DNA、2
’‑
F
‑
DNA、RNA和2
’‑
OMe
‑
DNA的活性提高的Stoffel片段突变株。

技术实现思路

[0004]Stoffel片段突变株SFM4
‑
3的所有突变位点，包含V518A、N583S、I614E、E615G、D655N、E681K、E742Q和M747R(以Taq DNA聚合酶第一个氨基酸开始)。
[0005]为了提高Stoffel片段突变株SFM4
‑
3合成全2
’‑
OMe修饰的非天然核酸的能力，使其能够合成更长的全2
’‑
OMe修饰的非天然核酸，本专利技术在Stoffel片段突变株SFM4
‑
3的基础上，针对拇指和手指关键位点残基520和681进行饱和突变，以获取更高活性的Stoffel片段突变株。
[0006]本专利技术第一目的在于提供Taq DNA聚合酶的Stoffel片段突变株SFM5
‑
7和SFM5
‑
46。
[0007]Stoffel片段突变株SFM5
‑
7是在SFM4
‑
3的基础上，进行双位点饱和突变，所含新增突变为E520P和K681R；Stoffel片段突变株SFM5
‑
46是在SFM4
‑
3的基础上，进行双位点饱和突变，所含新增突变为E520P和K681L，以及额外的氨基酸片段ALRLSQRLAIPYAPPPLR。
[0008]一种Stoffel片段突变株SFM5
‑
7，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]一种Stoffel片段突变株SFM5
‑
46，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]本专利技术第二目的在于提供上述Stoffel片段突变株的基因序列。
[0011]编码上述Stoffel片段突变株SFM5
‑
7的基因，其基因序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012]编码上述Stoffel片段突变株SFM5
‑
46的基因，其基因序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013]进一步的，所述Stoffel片段突变株SFM5
‑
7和SFM5
‑
46是将Stoffel片段突变株SFM4
‑
3通过酶分子突变的手段并筛选获得的新Stoffel片段突变株。
[0014]更进一步的，通过寡核苷酸引物构建Stoffel片段突变株SFM4
‑
3基因中序列中的E520、K681位点密码子的饱和突变文库。
[0015]优选的，对Stoffel片段突变株SFM4
‑
3基因序列中的E520、K681位点的密码子饱和突变文库进行筛选获得Stoffel片段突变株SFM5
‑
7、SFM5
‑
46。
[0016]进一步的，测定各Stoffel片段突变株SFM4
‑
3、SFM5
‑
7和SFM5
‑
46以DNA为模板对2
’‑
OMe
‑
dNTPs底物的合成活性，测定各突变株分别以2
’‑
F
‑
DNA、RNA和2
’‑
OMe
‑
DNA模板对dNTPs、2
’‑
F
‑
dNTPs、rNTPs和2
’‑
OMe
‑
dNTPs底物的合成活性。
[0017]本专利技术的第三目的在于提供第一目的所述Stoffel片段突变株在制备核酸制备产品中的应用。
[0018]进一步的，所述核酸制备包括以DNA为模板合成2
’‑
OMe
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.Stoffel片段突变株，其特征在于，所述Stoffel片段突变株包括如下两个Stoffel片段突变株：Stoffel片段突变株SFM5
‑
7，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，Stoffel片段突变株SFM5
‑
7是在Stoffel片段突变株SFM4
‑
3的基础上，进行双位点饱和突变，新增突变为E520P和K681R；Stoffel片段突变株SFM5
‑
46，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，Stoffel片段突变株SFM5
‑
46是在Stoffel片段突变株SFM4
‑
3的基础上，进行双位点饱和突变，新增突变为E520P和K681L，以及一段额外的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述的Stoffel片段突变株的基因，其特征在于，编码Stoffel片段突变株SFM5
‑
7的基因序列如SEQ ID NO.3所示；编码Stoffel片段突变株SFM5
‑
46的基因序列如SEQ ID NO.4所示。3.权利要求1所述的Stoffel片段突变株在制备核酸制备产品中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈庭坚，覃彦嘉，马星雲，陶睿，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：