一种热稳定性反转录酶突变体基因、制备方法和应用技术

本发明专利技术提出了一种具有热稳定性的反转录酶突变体的制备方法和应用，所述反转录酶为定向进化获得的突变体蛋白，该反转录酶突变体具有很高的热稳定性，同时具有和野生型反转录酶相当的酶活性。本发明专利技术的反转录酶可以用于以RNA为模板，合成互补的DNA链（cDNA）。将其克隆到pET28表达载体，在大肠杆菌中诱导表达，经固定化镍离子亲和纯化，制备反转录酶。将其用于反转录反应，合成cDNA，进行RNA检测与cDNA编码基因的克隆。基因的克隆。基因的克隆。

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性反转录酶突变体基因、制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种热稳定性反转录酶突变基因、制备方法和应用。

技术介绍

[0002]DNA聚合酶作为DNA复制的核心蛋白，以DNA为模板合成互补的DNA链，完成基因组DNA的复制和修复。DNA聚合酶主要功能以DNA单链作为模板，利用dNTP作为原料催化合成新的互补DNA。反转录酶本质上也是一种ＤＮＡ聚合酶，只不过可以用RNA作为模板，合成与RNA互补的DNA链（又称cDNA链）。反转录酶在RNA分子的检测与基因克隆方面有着重要应用。
[0003]反转录酶是一种特殊的DNA聚合酶，既能够利用RNA也能够利用DNA为模板，合成互补的DNA链。其中利用RNA为模板时的DNA聚合酶活性成为反转录酶。目前，常用的反转录酶为MMLV反转录酶，其具有很强的反转录酶活性，但热稳定较差。目前开发的一些热稳定性提高的反转录酶活性较低，需要开发热稳定性好、活性高的反转录酶。
[0004]DNA与RNA的检测在现在生命科学中具有广泛应用。例如，基于Taq酶的DNA扩增反应，在病毒、微生物等各种检测中具有各种应用。其中，RNA检测不同于DNA检测。绝大部分DNA聚合酶只能以DNA为模板进行DNA合成；而RNA的检测需要先把RNA先转化为DNA，才能够再利用Taq DNA聚合酶等来检测DNA。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提出一种热稳定性反转录酶的突变基因、制备方法和应用，所述热稳定性反转录酶同时具有DNA聚合酶活性与反转录酶活性，可在高温下应用于合成目的DNA、将RNA转录成DNA。
[0006]本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供一种热稳定性反转录酶突变体，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。
[0007]本专利技术进一步保护一种编码上述热稳定性反转录酶的突变基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。
[0008]本专利技术进一步保护一种上述的热稳定性反转录酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1. 构建热稳定性反转录酶的重组表达载体；S2. 将热稳定性反转录酶重组表达载体转入宿主细菌，并对宿主细菌进行扩大培养、诱导表达；S3. 收集诱导培养后的菌体，进行破碎、离心，得到上清液；S4. 对上清液进行纯化，得到所述热稳定性反转录酶。
[0009]本专利技术具有如下有益效果：本专利技术的热稳定性反转录酶具有高温稳定性，在65度仍具有活性，65度半衰期为1小时，可以在高温下以RNA为模板链延伸DNA，合成互补的DNA链（cDNA）。将热稳定性反转录酶在37
‑
65度进行反转录反应，合成cDNA，用于RNA检测与cDNA编
码基因的克隆。高温下的反转录反应能够消除RNA二级结构对cDNA合成的抑制作用，提高反转录反应合成cDNA的长度和速度。
附图说明
[0010]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0011]图1为热稳定性反转录酶的PCR结果；图2为热稳定性反转录酶的纯化结果；图3为热稳定性反转录酶的反转录反应结果。
[0012]图4为热稳定性反转录酶的热稳定性结果。
具体实施方式
[0013]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0014]热稳定性反转录酶的制备与应用S1. 原核重组表达载体的构建利用反转录酶的氨基酸序列，根据生物信息学分析确定了其影响热稳定性的关键残基，其突变后的基因序列见序列表中序列1所示。
[0015]首先合成突变型反转录酶基因，克隆到原核表达载体pET28中，构建重组表达载体。PCR扩增热稳定性反转录酶基因的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，该编码基因为2013bp的DNA片段。
[0016]引物序列如下：F1: 5
’‑
CCCCCCCATATGCTGAACATTGAAGATGAACAT
‑3’
R1: 5
’‑
CCCCCCGGATCCTCAAATCAGCAGGGTGCTGGTA
‑3’
使用NdeI和BamHI双酶切pET28载体与热稳定性反转录酶基因片段，并用DNA产物纯化试剂盒回收酶切产物。利用T4 DNA连接酶将热稳定性反转录酶基因与NdeI/BamHI双酶切的pET28进行重组，将重组产物其转化到DH5α感受态细胞中，挑取卡那霉素抗性筛选为阳性的菌落，进行菌液PCR验证，PCR验证阳性的重组克隆进行DNA序列测定，验证热稳定性反转录酶基因序列的正确性，最终构建成功热稳定性反转录酶的重组表达载体。
[0017]S2．重组热稳定性反转录酶的原核表达将热稳定性反转录酶的原核重组表达载体转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中。转化培养后的菌液均匀涂布于含有50mg/ml卡那霉素的固体LB平板上，37℃静置培养16小时。挑取单菌落至20ml添加有50mg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃
×
200r/min条件下摇床温育过夜。将20ml菌液转接扩大至500ml培养体系中，37℃
×
200r/min条件下继续培养，待OD
600
测定值达到0.6
‑
0.8，加入终浓度为0.1
‑
1.0mM的IPTG，在20℃
×
200r/min条件下
继续培养18h，诱导热稳定性反转录酶的表达。
[0018]S3．热稳定性反转录酶的亲和纯化将诱导后的大肠杆菌细胞，在8000r/min下离心3分钟，收集菌体细胞。用40ml裂解缓冲液（20 mM Tris
‑
HCl，pH8.0，300mM NaCl，10%甘油）重悬菌体细胞，进行超声波破碎细胞。超声破碎条件为500W功率下超声4s，间歇4s，总共超声30min。然后在4℃条件下10000r/min离心20分钟，收集上清液获得重组蛋白粗液。
[0019]将上清液加入到装有2ml Ni
‑
NTA纯化树脂的色谱柱，并让缓冲液流经色谱柱，以使热稳定性反转录酶N端所带的6个连续组氨酸亲和标签与Ni
‑
NTA树脂上固定的镍离子特异性结合。然后用含有20mM咪唑的裂解缓冲液洗涤树脂，除去树脂上非特异性结合的杂蛋白。接着用20ml洗脱缓冲液（含有250 mM咪唑）洗脱Ni
‑
NTA树脂，收集洗脱液，洗脱液含有热稳定性反转录酶。
[0020]将热稳定性反转录酶置换到储存溶液中：20 mM Tr本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种热稳定性的反转录酶，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。2.一种编码权利要求1所述热稳定性反转录酶突变基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。3.一种如权利要求1所述的热稳定性反转录酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1. 构建热...

【专利技术属性】
技术研发人员：金正，刘心菲，
申请(专利权)人：苏州拜科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：