丙酮酸激酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了丙酮酸激酶突变体及其应用。将芽孢杆菌属微生物中的丙酮酸激酶第101位氨基酸由苏氨酸(T)突变为赖氨酸(K)、精氨酸(R)或脯氨酸(P)后，腺苷产量均有提升，尤其以苏氨酸突变为赖氨酸后效果最好。丙酮酸激酶突变菌株pyk

【技术实现步骤摘要】
丙酮酸激酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于微生物工程
，具体地说，涉及丙酮酸激酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]核苷是一类糖苷的总称。核苷是核酸和核苷酸的组成成分。核苷是由D
‑
核糖或D
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Z
‑
脱氧核糖与嘧啶碱或嘌呤碱缩合而成。核苷一般为无色结晶，不溶于普通有机溶剂，易溶于热水，熔点为160～240℃。由D
‑
核糖生成的核苷称核糖核苷，参与RNA组成；由D
‑
α
‑
脱氧核糖生成的核苷称脱氧核糖核苷，参与DNA组成。D
‑
核糖与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶缩合生成相应的腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它们分别简称为腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、胸苷(T)和尿苷(U)。
[0003]鸟苷和肌苷在食品和医药行业有着广泛的作用。在食品领域，鸟苷和肌苷分别是鸟苷酸二钠和肌苷酸二钠的重要前体，而鸟苷酸二钠与肌苷酸二钠组合使用作为食品增鲜剂，广泛应用于鸡精、酱油等调味品中。在医药领域，鸟苷和肌苷可以作为多种抗病毒药物的医药中间体，如无环鸟苷、三氮唑核苷、三磷酸鸟苷钠等都需要鸟苷作为合成原料。肌苷是肌苷酸的重要前体，而肌苷酸可以作为合成腺苷酸(AMP)和鸟苷酸(GMP)的前体，适用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症、各种心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外还可治疗中心视网膜炎、视神经萎缩等。/>[0004]目前，微生物发酵是生产核苷的主要方法，主要使用的微生物包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等。在生长菌株的选育与改造过程中，通过使用紫外诱变、硫酸二乙酯诱变育种，定向选育核苷高产菌株；或者根据细菌中核苷酸的代谢路径和调节机理，深入了解菌株遗传背景及菌株特性，通过代谢工程手段，有目的性地对菌株进行改造，以获得性状优良、能够高产核苷的生产菌株。但目前核苷菌种的发酵性能仍较差，核苷的转化率仍较低，不能满足大规模工业化生产的需求。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种丙酮酸激酶突变体及其应用。
[0006]本专利技术的另一目的是提供一种核苷生产菌株及其构建方法与应用。
[0007]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种丙酮酸激酶突变体，所述突变体包含丙酮酸激酶第101位氨基酸由T到K、R或P的突变。
[0008]本专利技术中，丙酮酸激酶在NCBI上的参考序列编号为NP_390796.1。
[0009]第二方面，本专利技术提供编码所述丙酮酸激酶突变体的核酸分子。
[0010]第三方面，本专利技术提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
[0011]第四方面，本专利技术提供所述核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料的以下任一应用：
[0012](1)用于核苷的发酵生产；
[0013](2)用于提高核苷的发酵产量；
[0014](3)用于构建产核苷的基因工程菌。
[0015]第五方面，本专利技术提供一种核苷生产菌株的构建方法，利用基因工程手段，在具有核苷生产能力的微生物基因组中引入突变，使其编码的丙酮酸激酶包含T101K、T101R或T101P突变位点。
[0016]其中，所述微生物为芽孢杆菌属(Bacillus)菌种。
[0017]优选地，所述微生物为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)等，更优选Bacillus.subtilis A1，菌株A1可参见CN201910599510.8。
[0018]第六方面，本专利技术提供按照所述方法构建得到的核苷生产菌株。
[0019]第七方面，本专利技术提供所述菌株在核苷发酵生产或提高核苷发酵产量中的应用。
[0020]第八方面，本专利技术提供一种生产核苷的方法，所述方法包括如下步骤：
[0021]a)培养所述核苷生产菌株，以获得所述菌株的培养物；
[0022]b)从步骤a)中获得的所述培养物中收集所产生的核苷。
[0023]所述核苷包括腺苷、肌苷、鸟苷等核苷或对应的核苷衍生物，如次黄嘌呤、肌苷酸、鸟嘌呤、鸟苷酸、核黄素、二乙酰鸟苷酸等。
[0024]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0025]将芽孢杆菌属(Bacillus)微生物中的丙酮酸激酶第101位氨基酸由苏氨酸(T)突变为赖氨酸(K)、精氨酸(R)或脯氨酸(P)后，腺苷产量均有提升，尤其以苏氨酸(T)突变为赖氨酸(K)后效果最好。丙酮酸激酶突变菌株pyk
T101K
与出发菌株A1相比，腺苷产量由1.3g/L提高到2.1g/L最高；丙酮酸激酶突变菌株pyk
T101R
与出发菌株A1相比，肌苷产量由0.6g/L提高到1.1g/L最好。本专利技术为大规模生产核苷提供有效手段，应用前景广阔。
具体实施方式
[0026]本专利技术旨在提供一种利用微生物生产嘌呤核苷的方法，以及能够高效率生产嘌呤核苷的新微生物。
[0027]研究发现，经过修饰枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的丙酮酸激酶(由pyk基因编码)，使得微生物能够高效率地生成腺苷和肌苷，并且成功创制出能够高效生产核苷的新微生物，从而完成了本专利技术。
[0028]本专利技术采用如下技术方案：
[0029]本专利技术提供一种枯草芽孢杆菌，其细胞内由pyk基因编码的丙酮酸激酶的第101位氨基酸由苏氨酸(T)突变为苏氨酸之外的其他氨基酸，优选赖氨酸(K)、精氨酸(R)或脯氨酸(P)，分别获得丙酮酸激酶突变体T101K、T101R、T101P。丙酮酸激酶突变体T101K、T101R、T101P的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、4和6所示，它们的核酸序列分别如SEQ ID NO:1、3和5所示。
[0030]pyk基因编码的丙酮酸激酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成丙酮酸(PYR)，这个过程伴随着1分子的ADP的消耗，同时产生1分子的ATP。本专利技术通过对pyk基因进行修饰，实现了对丙酮酸激酶的突变，使所述微生物产生核苷的能力与未修饰的菌株相比增强，最终
提高了腺苷和肌苷的产量。
[0031]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0032]以下实施例中所用引物如表1所示：
[0033]表1
[0034]引物名称引物序列(5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.丙酮酸激酶突变体，其特征在于，所述突变体包含丙酮酸激酶第101位氨基酸由T到K、R或P的突变；其中，丙酮酸激酶在NCBI上的参考序列编号为NP_390796.1。2.编码权利要求1所述丙酮酸激酶突变体的核酸分子。3.含有权利要求2所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。4.权利要求2所述核酸分子或权利要求3所述生物材料的以下任一应用：(1)用于核苷的发酵生产；(2)用于提高核苷的发酵产量；(3)用于构建产核苷的基因工程菌。5.核苷生产菌株的构建方法，其特征在于，利用基因工程手段，在具有核苷生产能力的微生物基因组中引入突变，使其编码的丙酮酸激酶包含T101K、T101R或T101P突变位点；其中，丙酮酸激酶在NCBI上的参考序列编号...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴涛，薛婷莉，栾明月，姚佳琪，胡丹，张庆帅，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：