一种突变型TaqDNA聚合酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种突变型Taq DNA聚合酶及其应用。本发明专利技术首先公开了突变型Taq DNA聚合酶，其在SEQ ID NO.1所示的序列中，具有下述一个氨基酸位置上的氨基酸取代，所述取代用三联体表示：字母

【技术实现步骤摘要】
一种突变型Taq DNA聚合酶及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
更具体地，涉及一种突变型Taq DNA聚合酶及其应用。

技术介绍

[0002]土壤是微生物栖息的主要场所，微生物在土壤中的分布及生命活动与土地肥力、植物营养、植物病害等情况密切相关，因此利用微生物形态、培养特性、生理生化特性和遗传特性对土壤微生物进行研究和分类鉴定是对土壤环境研究的重要方法。但是由于各种条件的限制85％～99％的土壤微生物很难被分离鉴定，使得土壤微生物研究受到一定制约。利用传统方法进行微生物学的分离纯化检测方法会极大的低估样品中微生物的多样性，也会忽略一些含量极低的微生物种类。因此，基于PCR技术的分子生物学方法应用与土壤生物的研究弥补了传统微生物学研究的不足。
[0003]土壤理化性质极为复杂，粗提取的土壤DNA中含有腐植酸、酚类化合物和重金属离子等抑制性污染物。其中，腐植酸和腐植酸类似物的抑制作用又最为明显，它们通过干扰裂解、降解核酸或非特异性吸附和抑制酶活性的方式干扰正常的PCR扩增体系。在土壤DNA的提取过程中，腐植酸会与DNA紧密结合，很难分离，并且，极低浓度的腐植酸(0.08μg/ml)足以抑制DNA聚合酶的活性。因此减少腐植酸的抑制作用，成为了研究土壤微生物多样性研究的关键。目前有很多对于土壤中和水环境的活性污泥细菌种类的研究，需要通过荧光定量PCR的技术方法进行准确的定性和定量。荧光定量PCR准确性的前提是活性污泥中的微生物尽可能地被抽提完全、模板质量好、纯度较高，以及其中存在的抑制物被尽可能地去除干净。
[0004]为了实现土壤中样品DNA的扩增，通常需要技术手段来除去样品中的腐植酸残留，腐殖酸的去除工艺较为繁琐，目前去除腐殖酸的有效方法主要为膜技术、离子交换、催化氧化法等，这些方法的缺点在于需要引入其他步骤，并且在去除过程中可能引入其他污染。所以在研发土壤直扩产品时，一般通过稀释的方法可以降低腐植酸浓度，同时DNA浓度也会收到稀释而影响实验结果。其他去除腐植酸的提取方法则十分复杂且效果得不到保证。为了简化实验过程，通过对DNA聚合酶的改造可以使酶本身耐受较高浓度腐植酸的抑制作用，从而降低对DNA样品的制备要求，也在可以将改造后的酶应用于宏基因组直扩实验中，简化实验步骤，提高实验效率。
[0005]Taq DNA聚合酶是从火山温泉中分离得到的一种水生栖热菌(Thermus aquaticus)中发现的，因此具有极高的热稳定性，能够承受PCR过程中的热变性步骤，成为了第一代热稳定性DNA聚合酶。由于其稳定性、易表达纯化、强大的扩增效率等特征，Taq DNA聚合酶被广泛应用于荧光定量PCR中。但野生型Taq DNA聚合酶对于腐植酸的耐受力较弱，在较低浓度的腐植酸存在的情况下聚合酶活性被显著抑制，最终影响实验结果。
[0006]因此，为了实现DNA样本在复杂环境中的扩增，需要对野生型Taq DNA聚合酶进行一系列改造，使其在环境耐受程度、稳定性、催化活力等方面的性能进一步提高。
DNA聚合酶(Thermus aquaticus)。通过兼并引物的设计，将705位的丙氨酸随机突变为任意氨基酸。通过蛋白表达与筛选，筛选出两种突变体蛋白，均可以耐受PCR体系中的高浓度腐植酸，分别为A705E与A705K，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示，基因序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示。
[0027]本专利技术的有益效果如下：
[0028]本专利技术突变型Taq DNA聚合酶通过在野生型Taq DNA聚合酶上对A705位点进行了氨基酸替换改变了聚合酶的构象，在同等条件下的扩增效率、扩增长度等指标均有所提升，同时提高了Taq DNA聚合酶对于腐植酸及腐植酸类似物的耐受能力，可以耐受较高浓度的腐植酸，将腐植酸的耐受能力由5ng/μl提升至25ng/μl以上且依然保有较高的酶活，对于土壤微生物提取物的扩增能力有了极大的提升，在土壤微生物多样性的检测、环境致病微生物的监测等领域有重大价值。另外，本专利技术突变型Taq DNA聚合酶可以实现复杂样本中的DNA扩增实验，也可以直接应用于DNA直扩实验中。
附图说明
[0029]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。
[0030]图1为野生型Taq DNA聚合酶(WT)与突变体Taq酶在腐殖酸的胁迫下进行的压力筛选的结果图，其中：泳道M：Plus II DNA Marker(Transgen Biotech)；泳道1：正常体系中WT的PCR产物；泳道2：体系中含有10ng/ul腐植酸的WT的PCR产物；泳道3：体系中含有30ng/ul腐植酸的WT的PCR产物；泳道4：体系中含有40ng/ul腐植酸的WT的PCR产物；泳道5：体系中含有50ng/ul腐植酸的WT的PCR产物；泳道6：正常体系中突变体Taq酶的PCR产物；泳道7：体系中含有10ng/ul的腐植酸的突变体Taq酶的PCR产物；泳道8：体系中含有30ng/ul的腐植酸的突变体Taq酶的PCR产物；泳道9：体系中含有40ng/ul的腐植酸的突变体Taq酶的PCR产物；泳道10：体系中含有50ng/ul的腐植酸的突变体Taq酶的PCR产物。
[0031]图2为野生型Taq DNA聚合酶(WT)与突变型Taq DNA聚合酶A705E和A705K进行纯化后的PAGE胶图。
[0032]图3为纯化后的野生型Taq DNA聚合酶(WT)与突变型Taq DNA聚合酶A705E和A705K在不同浓度的腐殖酸存在下，以Hela细胞基因组DNA为模板，对850kp长的基因进行扩增的琼脂糖电泳胶图。
具体实施方式
[0033]为了更清楚地说明本专利技术，下面结合优选实施例和附图对本专利技术做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本专利技术的保护范围。
[0034]下述实施例中所用到的引物如表1所示：
[0035]表1引物序列
[0036][0037]备注：N＝A、T、C或G。
[0038]实施例1耐受腐殖酸的突变型Taq DNA聚合酶的获得
[0039]通过检索NCBI和蛋白质数据库PDB，得到突变型Taq DNA聚合酶的蛋白质序列(SEQ ID NO.1所示，其基因序列包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列)与结构，通过对序列与结构的分析与比对，选择705位点的丙氨酸(Ala,A)进行饱和突变改造，形成包含有多种突变体质粒的文库，通过添加筛选压力对文库进行筛选，最终筛选出耐受腐植酸的突变型Taq DNA聚合酶。
[0040]具体步骤如下：
[0041]一、突变体文库的建立
[0042]根据SEQ ID NO.2所示的序列设计引物，需在引物上添加限制性酶切位点EcoR I/Sal I。具体步骤为：以SEQ ID NO.2所示的序列为模板利用引物Taq
‑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种突变型Taq DNA聚合酶，其特征在于，所述突变型Taq DNA聚合酶在SEQ ID NO.1所示的序列中，具有下述一个氨基酸位置上的氨基酸取代，所述取代用三联体表示：字母
‑
数字
‑
字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸：A705E或A705K。2.根据权利要求1所述的突变型Taq DNA聚合酶，其特征在于，所述突变型Taq DNA聚合酶为如下任一所示的蛋白质：a1)由SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；a2)在SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有所述突变型Taq DNA聚合酶活性的由a1)衍生的蛋白质；a3)与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列具有80％及以上同一性的具有所述突变型Taq DNA聚合酶活性的蛋白质。3.编码权利要求1或2所述的突变型...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐欣，宋新文，耿亮，辛文，
申请(专利权)人：北京全式金生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：