CrCl2在TUNEL技术检测细胞凋亡中的应用制造技术

本发明专利技术公开CrCl2在TUNEL技术检测细胞凋亡中的应用。本发明专利技术首先公开了CrCl2在TUNEL技术检测细胞凋亡中的应用。进一步公开了TdT反应缓冲液体系，其包含HEPES、NaCl、CoCl2、MgCl2、DTT、dATP和CrCl2。本发明专利技术首次发现CrCl2存在于TdT反应缓冲液体系中能够催化TdT反应，能够为末端脱氧核苷酸转移酶反应提供较优的反应环境，无论是基于Click反应的TUNEL试剂盒还是传统TUNEL试剂盒均适用，包含CrCl2的TdT反应缓冲液体系毒性低，在TUNEL技术检测细胞凋亡时具有检测灵敏度高、特异性强和操作步骤简单快速等优点，可用于不同细胞和组织样本的检测。检测。检测。

【技术实现步骤摘要】
CrCl2在TUNEL技术检测细胞凋亡中的应用


[0001]本专利技术涉及细胞检测
更具体地，涉及CrCl2在TUNEL技术检测细胞凋亡中的应用。

技术介绍

[0002]细胞凋亡(Apoptosis)又称细胞程序性死亡，细胞凋亡对于生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中至关重要。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制(Kerr,J,F. R.,A.H.Wyllie,andA.R.CtLrrie.1972.Apoptosis:basic biological henomenonwith wide
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ranging implications in tissue kinetics.Br.J.Cancer.26:239
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257.； Wyllie AH:Glucocorticoid
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induced thymocyte apoptosis is associated withendogenous endonuclease activation.Nature 1980,284:555
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556)。但是迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如肿瘤、自身免疫性疾病等，凋亡途径中的成分可被作为治疗的靶点。因此，识别和量化凋亡的能力对于推进这些领域的研究至关重要。
[0003]1992年底首次发表了TdT(末端脱氧核苷酸转移酶)介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)。TUNEL能够利用生化标记暴露的DNA末端，从而将含有DNA片段的细胞核可视化。细胞凋亡的生化特征之一是染色质裂解成单个或者多个寡核苷酸小体长度的片段，从而在DNA上产生了游离的 3'
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hydroxyl termini。TUNEL染色通过末端脱氧核苷酸转移酶将标记的dUTP与基因组DNA片段上游离的3'
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hydroxyl termini结合。尽管TUNEL用作原位检测细胞凋亡的方法，但其并不局限于检测凋亡细胞(Watanabe M,Hitomi M,vander Wee K,Rothenberg F,Fisher SA,Zucker R,Svoboda KK,Goldsmith EC, Heiskanen KM,Nieminen AL.The pros and cons of apoptosis assays for use in thestudy of cells,tissues,and organs.Microsc Microanal 2002；8:375
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91.)。从某种意义上来说TUNEL是非特异性的，它并不会考虑这些DNA末端的形成机制从而标记所有游离的3'
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hydroxyl termini，也可检测出非凋亡细胞，包括坏死细胞、DNA修复细胞、物理损伤细胞甚至是基因转录活跃的细胞(Vladimir V. Didenko(ed.),DNA Damage Detection In Situ,Ex Vivo,and In Vivo:Methods andProtocols,Methods in Molecular Biology,vol.682,DOI 10.1007/978
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60327
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409
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8_2)。
[0004]目前市面上关于TUNEL细胞凋亡检测试剂盒主要包括传统TUNEL试剂盒和基于Click反应的TUNEL试剂盒。传统TUNEL试剂盒主要是使用抗体或荧光素或生物素修饰的dUTP大分子，其分子量大，不容易被TdT酶掺入，且产物荧光单一。基于Click反应的TUNEL试剂盒使用炔烃基团修饰的dUTP (EdUTP)，不仅容易被TdT酶掺入，相同条件下检测到更高比例凋亡细胞，而且有多色荧光可选，但两步法实验周期相对一步法较长。现阶段针对TUNEL 检测细胞凋亡的技术在不断革新，但细胞生物学实验基本都会面临问题包括非特异强、背景强、染色效率低等现象。
[0005]因此，本专利技术研发出一种针对TUNEL技术的新型缓冲反应液体系，以解决上述问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一个目的在于提供CrCl2在TUNEL技术检测细胞凋亡中的应用。
[0007]本专利技术的第二个目的在于提供一种末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)反应缓冲液体系，其毒性低，能够在TUNEL技术检测细胞凋亡时为TdT反应提供较优的反应环境，提高灵敏度，降低非特异性。
[0008]本专利技术的第三个目的提供一种TdT反应缓冲液体系在TUNEL技术检测细胞凋亡中的应用。
[0009]为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0010]根据本专利技术第一个目的，本专利技术提供了CrCl2在TUNEL技术检测细胞凋亡中的应用或在制备TUNEL技术检测细胞凋亡的产品中的应用。
[0011]可选的，所述CrCl2的浓度为0.01
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0.5mM；优选的，为0.1mM。
[0012]根据本专利技术第二个目的，本专利技术提供了一种TdT反应缓冲液体系，其包含HEPES、NaCl、CoCl2、MgCl2、DTT、dATP和CrCl2；优选的，所述HEPES 的pH为7.2。
[0013]可选的，所述CrCl2的浓度为0.01
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0.5mM；优选的，为0.1mM。
[0014]可选的，所述HEPES的浓度为10
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60mmol/L、所述NaCl为100
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150mM、所述CoCl2的浓度为1
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10mM，所述MgCl2的浓度为0.1
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1mM、所述DTT的浓度为2
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10mM、所述dATP的浓度为1
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20mM。
[0015]包含上述TdT反应缓冲液体系的试剂盒也在本专利技术的保护范围之内。
[0016]根据本专利技术第三个目的，本专利技术提供了上述TdT反应缓冲液体系在 TUNEL技术检测细胞凋亡中的应用，或在制备TUNEL技术检测细胞凋亡产品中的应用。
[0017]本专利技术中所述TUNEL技术既包括基于Click反应的TUNEL技术也包括传统TUNEL技术(采用荧光素、生物素或抗体标记的dUTP)。
[0018]本专利技术的有益效果如下：
[0019]本专利技术首次发现CrCl2存在于TdT反应缓冲液体系中能够催化TdT反应，能够为末端脱氧核苷酸转移酶反应提供较优的反应环境，增强末端脱氧核苷酸转移酶活性，无论是基于Click反应的TUNEL试剂盒还是传统TUNEL试剂盒均适用。包含CrCl2的TdT反应缓冲液体系在TUNEL技术检测细胞凋亡时存在如下优势：
[0020]1、检测灵敏度高，可将较低凋亡信号进行放大，检测到更高比例的凋亡细胞；
[0021]2、特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.CrCl2在TUNEL技术检测细胞凋亡中的应用。2.CrCl2在制备TUNEL技术检测细胞凋亡的产品中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述CrCl2的浓度为0.01
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0.5mM。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述CrCl2的浓度为0.1mM。5.一种TdT反应缓冲液体系，其特征在于，所述TdT反应缓冲液体系包含HEPES、NaCl、CoCl2、MgCl2、DTT、dATP和CrCl2；优选的，所述HEPES的pH为7.2。6.根据权利要求5所述的TdT反应缓冲液体系，其特征在于，所述CrCl2的浓度为0.01
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0.5mM；优选的，为0.1mM。7.根据权利要求5所述的TdT反应缓冲液体系，其特征在于，所述HEPES的浓度为10
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【专利技术属性】
技术研发人员：张珊珊，马静，辛文，
申请(专利权)人：北京全式金生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：