【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物。更具体地，涉及一种封闭pfu dna聚合酶突变体聚合活性的单克隆抗体组合及其应用。
技术介绍
1、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)技术已被广泛应用于分子生物实验中。pcr技术以dna为模板，以小片段的单链dna为引物，在dna聚合酶的作用下将dntps合成为dna新链。因此dna聚合酶是实现dna体外复制的关键。
2、pfu dna聚合酶(又称pfu聚合酶，或pfu酶)是b族聚合酶中最常用的一种，pfu dna聚合酶是一种来源于嗜热古细菌(pyrococcus furiosus,pfu)中分离的高度热稳定的dna聚合酶。它在生物体内对dna复制起重要作用，具有5’-3’端的dna聚合酶活性和3’-5’端的校正活性，这两种活性分别是pfu酶两个相对独立的结构域(聚合酶结构域和外切酶结构域)在发挥作用。其中聚合酶结构域又分为thumb结构域和palm结构域，是pfu酶的催化活性中心，以及结合dna底物的关键部位。因为pfu酶外切酶结构域的存在，使得其在dna复制过程中碱基的突变率很低，仅为1.3×10－6(pavlov a r,pavlova n v,kozyavkin s a,etal.recent developments in the optimization of thermostable dna polymerasesfor efficient applications[j].trends in biotechnology.2004,22(5):2
3、目前热启动是普遍采用的解决该问题的方法。现在商品化的热启动聚合酶是通过对聚合酶不同的修饰进行热启动的。常用的修饰方式有：抗体修饰法(kellogg de,rybalkin i,chen s,et al.taqstart antibody:"hot start"pcr facilitated by aneutralizing monoclonal antibody directed against taq dna polymerase[j].biotechniques.1994,16(6):1134-7.)、化学修饰法(moretti t,koons b,budowleb.enhancement of pcr amplification yield and specificity using amplitaq golddna polymerase[j].biotechniques.1998,25(4):716-22.)、核酸适配体法(kainz p,schmiedlechner a,strack hb.specificity-enhanced hot-start pcr:addition ofdouble-stranded dna fragments adapted to the annealing temperature[j].biotechniques.2000,28(2):278-82.)、重组修饰法(kermekchiev mb,tzekov a,barneswm.cold-sensitive mutants of taq dna polymerase provide a hot start for pcr[j].nucleic acids res.2003,31(21):6139-47.)以及一些特殊的纳米材料修饰(li h,huang j,lv j,et al.nanoparticle pcr:nanogold-assisted pcr with enhancedspecificity[j].angew chem int ed engl.2005,44(32):5100-3.)。其中，化学修饰法缺点为抑制效果实验的可重复性和可控性较差；核酸适配体法、重组修饰法及一些特殊的纳米材料修饰通常是比较困难的，且成本较高。特异性抗体在低温条件下能抑制聚合酶的活性，降低反应的非特异性扩增，还能有利于聚合酶的长期热稳定性，因此，抗体修饰法已被广泛应用于taq dna聚合酶的热启动反应中(sharkey dj,scalice er,christy kgjr.antibodies as thermolabile switches:high temperature triggering for thepolymerase chain reaction[j].biotechnology.1994,12(5):506-509.)。
4、目前对于pfu dna聚合酶的封闭抗体，仅有个别针对3’-5’外切酶结构域(cn111533806a)和纳米抗体(cn116444675a)的报道。而对于pfu dna聚合酶的聚合酶结构域进行封闭，使其在低温下不与非扩增目标区的模板dna结合，有效降低非特异性产物的扩增，增加特异性产物产量，未见报道。
5、因此，对于具有聚合酶结构域突变的pfu dna聚合酶，急需开发一种能够特异性封闭其聚合酶结构域活性，进而进一步提升整个pfu dna聚合酶全酶性能的抗体。
技术实现思路
1、本专利技术的一个目的在于提供封闭pfu dna聚合酶突变体聚合活性的单克隆抗体组合，以克服现有pfu dna聚合酶突变体在扩增长复杂基因组模板时出现的特异性差，目的基因产物产量低等问题。
2、本专利技术的另一个目的在于提供上述单克隆抗体组合在降低pfu dna聚合酶的非特异性扩增和/或提高pcr产物产量中的应用。
3、为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
4、本专利技术首先提供了一种封闭pfu dna聚合酶突变体聚合活性的单克隆抗体组合，所述单克隆抗体组合包括单克隆抗体1h3和/或单克隆抗体6b8；
5、所述单克隆抗体1h3含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的互补决定域cdr1、cdr2和cdr3分别如seq id no.1第26-33位、seq id no.1第51-58位和seq id no.1第97-109位所示；所述轻链可变区的互补决定域cdr1、cdr2和cdr3分别如seq id no.2第27-36位、seq id no.2第54-56位和seq id no.2第93-101位所示；
6、所述单克隆抗体6b8含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的互补决定域cdr1、cdr2和cdr3分别如seq id no.3第26-33位、seq id no.3第51-58位和seq id no.3第97-103位所示；所述轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3分别为se本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种封闭Pfu DNA聚合酶突变体聚合活性的单克隆抗体组合，其特征在于，所述单克隆抗体组合包括单克隆抗体1H3和/或单克隆抗体6B8；
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体组合，其特征在于，所述单克隆抗体1H3的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述单克隆抗体6B8的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.权利要求1或2所述的单克隆抗体组合或与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％及以上同一性的单克隆抗体组合在封闭Pfu DNA聚合酶突变体聚合活性中的应用。
4.权利要求1或2所述的单克隆抗体组合或与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％及以上同一性的单克隆抗体组合在降低Pfu DNA聚合酶
5.权利要求1或2所述的单克隆抗体组合或与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％及以上同一性的单克隆抗体组合在提高PCR产物产量中的应用。
6.一种反应体系，其特征在于，所述反应体系包括权利要求1或2所述的单克隆抗体组合和Pfu DNA聚合酶突变体。
7.根据权利要求6所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系中单克隆抗体1H3、单克隆抗体6B8和Pfu DNA聚合酶突变体的摩尔比为4:1、2:1、1:1和2:1、1:1、0.5:1；优选的，为4:1、2:1和1:1、0.5:1；更优选的，为2:1和1:1。
8.根据权利要求6所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系还包括反应液；所述反应液各物质在反应体系中的终浓度为80mM Tris-HCl、40mM K2SO4、10mM(NH4)2SO4、0.18mg/mL BSA、10％Glycerin、3mM MgSO4、0.4mM dNTPs；优选的，所述Tris-HCl的pH为9.0。
9.根据权利要求6-8任一所述的反应体系在DNA扩增中的应用。
10.权利要求1或2所述的单克隆抗体组合，或，权利要求3-5和9任一所述的应用，或，权利要求6-8任一所述的反应体系，其特征在于，所述Pfu DNA聚合酶突变体为具有Thumb结构域和Palm结构域的Pfu DNA聚合酶突变体；
...【技术特征摘要】
1.一种封闭pfu dna聚合酶突变体聚合活性的单克隆抗体组合，其特征在于，所述单克隆抗体组合包括单克隆抗体1h3和/或单克隆抗体6b8；
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体组合，其特征在于，所述单克隆抗体1h3的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no.2所示；所述单克隆抗体6b8的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.3所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.4所示。
3.权利要求1或2所述的单克隆抗体组合或与seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％及以上同一性的单克隆抗体组合在封闭pfu dna聚合酶突变体聚合活性中的应用。
4.权利要求1或2所述的单克隆抗体组合或与seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％及以上同一性的单克隆抗体组合在降低pfu dna聚合酶突变体的非特异性扩增中的应用。
5.权利要求1或2所述的单克隆抗体组合或与seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3和seq id no....
【专利技术属性】
技术研发人员：王文娟，李行，李奎奎，王超，陈亚慧，李可欣，安宁，郭芳，宋新文，耿亮，马静，辛文，
申请(专利权)人：北京全式金生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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