叶酸在促进人多能性干细胞向心肌细胞分化中的应用制造技术

本发明专利技术公开叶酸在促进人多能性干细胞向心肌细胞分化中的应用，并进一步公开了一种用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合。所述培养基组合包含第一诱导分化培养基、第二诱导分化培养基和/或第三诱导分化培养基。本发明专利技术还公开了一种促进人多能性干细胞向心肌细胞分化的方法。本发明专利技术首次发现叶酸可以促进人多能性干细胞向心肌细胞分化，通过添加叶酸可在7

【技术实现步骤摘要】
叶酸在促进人多能性干细胞向心肌细胞分化中的应用


[0001]本专利技术涉及干细胞生物学与再生医学
更具体地，涉及叶酸在促进人多能性干细胞向心肌细胞分化中的应用。

技术介绍

[0002]心脏疾病是现代社会高发病率和高致死率的重大疾病之一，严重威胁着人类健康和社会稳定。成年人的心肌细胞几乎不具备分裂增殖的能力，在发生诸如心肌梗塞、心肌缺血等心脏组织坏死性疾病时，不能通过心肌细胞的再生来修复坏死组织，所以这类疾病引起的心脏功能衰退是不可逆转的，至今仍缺少行之有效的治疗方法。目前，临床上大多通过药物治疗，只能达到缓解的效果，增加心肌收缩力，提高心脏的泵血能力，但心脏负担的加重反而导致病情恶化。用正常的心肌细胞移植替换已坏死的细胞是从根本上治疗这类心脏疾病的方法之一，但因为人成体心肌细胞已失去自我增殖的能力，寻找人心肌细胞的来源成为目前再生医学治疗心脏疾病亟需解决的问题。
[0003]人多能性干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs，包含人胚胎干细胞hESCs和人诱导多能干细胞hiPSCs)是一种多潜能干细胞，能在体外自我更新，诱导分化为内胚层、中胚层和外胚层三个胚层来源的细胞，提供了大量潜在的基于细胞替代疗法的应用。其中，中胚层来源的细胞如心肌细胞等，广泛应用于心脏疾病、器官发育、药物研发、药效评测、药毒测试和细胞治疗的基础研究和临床前研究。使用干细胞分化来的心肌细胞进行替代治疗，为彻底治疗心脏疾病提供了可能。因此，建立高效的心肌细胞定向分化方法是获得心肌细胞的关键。/>[0004]目前，利用人多能性干细胞诱导分化为心肌细胞的产品和方法较多，但是，分化产品来源不稳定、批间差异大、体外扩增和分化潜能差、价格高昂等缺点严重制约行业的发展。因此，急需研发化学成分明确、无动物源成分、批次稳定且分化效率高的人心肌细胞分化产品以促进人多能性干细胞向心肌细胞分化。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个目的在于提供叶酸在促进人多能性干细胞向心肌细胞分化中的应用。
[0006]本专利技术的第二个目的在于提供一种用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合，该培养基组合中各培养基具有成分明确、无异源成分、批次稳定、分化效率高等特点。
[0007]本专利技术的第三个目的在于提供一种促进人多能性干细胞向心肌细胞分化的方法，该方法可在7
‑
10天将人多能性干细胞分化为可以搏动的人心肌细胞，15天可获得cTnT(心肌细胞标志物)表达阳性比例高于80％的心肌细胞。
[0008]为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0009]根据上述第一个目的，本专利技术提供叶酸在促进人多能性干细胞向心肌细胞分化中
的应用。
[0010]可选的，所述叶酸的浓度为1μM～3μM。
[0011]根据上述第二个目的，本专利技术提供用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合，其包含第一诱导分化培养基、第二诱导分化培养基和/或第三诱导分化培养基；
[0012]所述第一诱导分化培养基包含基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物A；
[0013]所述第二诱导分化培养基包含基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物B；
[0014]所述第三诱导分化培养基包含基础培养基、叶酸和其他诱导分化组分。
[0015]可选的，所述叶酸的浓度为1μM～3μM。
[0016]可选的，所述基础培养基包括RPMI 1640培养基、IMDM培养基、DMEM/F12培养基中的一种或几种。
[0017]可选的，所述其他诱导分化组分包括转铁蛋白、L
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抗坏血酸、亚硒酸钠、乙醇胺、L
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肉毒碱、过氧化氢酶、还原型谷胱甘肽、胰岛素、超氧化物歧化酶、T3、半乳糖酶、腐胺、皮质酮、亚油酸、亚麻酸、孕酮、DL
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α生育酚、DL
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α
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生育酚乙酸酯、油酸、哌酸和生物素中的一种或几种。优选的，所述其他诱导分化组分包括转铁蛋白、L
‑
抗坏血酸、亚硒酸钠、乙醇胺、L
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肉毒碱、腐胺、亚油酸和生物素。更优选的，所述转铁蛋白的浓度为10ng/mL～30ng/mL，所述L
‑
抗坏血酸的浓度为100μg/mL～500μg/mL，所述亚硒酸钠的浓度为10ng/mL～20ng/mL，所述乙醇胺的浓度为1μg/mL～3μg/mL，所述L
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肉毒碱的浓度为1μg/mL～5μg/mL，所述腐胺的浓度为10ng/mL～20ng/mL，所述亚油酸的浓度为0.5μg/mL～2μg/mL，所述生物素的浓度为0.1μg/ml～0.5μg/ml；最优选的，所述转铁蛋白的浓度为20ng/mL，所述L
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抗坏血酸的浓度为300μg/mL，所述亚硒酸钠的浓度为15ng/mL，所述乙醇胺的浓度为2μg/mL，所述L
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肉毒碱的浓度为3μg/mL，所述腐胺的浓度为15ng/mL，所述亚油酸的浓度为1μg/mL，所述生物素的浓度为0.3μg/ml。
[0018]可选的，所述小分子化合物A为GSK
‑
3β抑制剂(Wnt信号通路激活剂)，为CHIR99021、LY2090314、SB216763、SB415286中的一种或几种。
[0019]可选的，所述小分子化合物B为Wnt信号通路抑制剂，为WntC59、IWP1、IWP2、IWP3、IWP4、IWR1、IWR2、IWR3、IWR4、IWR5中的一种或几种。
[0020]优选的，所述GSK
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3β抑制剂(Wnt信号通路激活剂)为CHIR99021，其浓度为1μM～10μM，更优选的为5μM；所述Wnt信号通路抑制剂为IWP2，其浓度为1μM～10μM，更优选的为5μM。Wnt信号通路的适当调节足以实现有效的心肌分化，CHIR99021是一种有效的药理性Wnt信号通路的激活剂，可促进人多能性干细胞快速有效地转化为中胚层；IWP2是一种Wnt信号抑制剂，可选择性阻断Wnt棕榈酰化，因此使用CHIR99021和IWP2来激活和抑制经典Wnt信号传导。
[0021]根据上述第三个目的，本专利技术还提供一种促进人多能性干细胞向心肌细胞分化的方法，该方法包括至少四个阶段：
[0022]诱导分化前阶段：用TeSR
‑
E8、mTeSR1或E8培养基中的一种或多种传代培养人多能性干细胞，培养2
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5天，至细胞密度为80％
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100％；其中包括在含有10μM Y27632的TeSR
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E8、mTeSR1或E8培养基中培养1天；
[0023]第一诱导分化阶段：用上述第一诱导分化培养基诱导分化培养2天；
[0024]第二诱导分化阶段：用上述第二诱导分化培养基诱导分化培养2天；
[0025]第三诱导分化阶段：用上述第三诱导分化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.叶酸在促进人多能性干细胞向心肌细胞分化中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述叶酸的浓度为1μM～3μM。3.用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合，其特征在于，所述培养基组合包含第一诱导分化培养基、第二诱导分化培养基和/或第三诱导分化培养基；所述第一诱导分化培养基包含基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物A；所述第二诱导分化培养基包含基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物B；所述第三诱导分化培养基包含基础培养基、叶酸和其他诱导分化组分。4.根据权利要求3所述的培养基组合，其特征在于，所述叶酸的浓度为1μM～3μM。5.根据权利要求3或4所述的培养基组合，其特征在于，所述基础培养基包括RPMI 1640培养基、IMDM培养基、DMEM/F12培养基中的一种或几种。6.根据权利要求3或4所述的培养基组合，其特征在于，所述其他诱导分化组分包括转铁蛋白、L
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抗坏血酸、亚硒酸钠、乙醇胺、L
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肉毒碱、过氧化氢酶、还原型谷胱甘肽、胰岛素、超氧化物歧化酶、T3、半乳糖酶、腐胺、皮质酮、亚油酸、亚麻酸、孕酮、DL
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α生育酚、DL
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α
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生育酚乙酸酯、油酸、哌酸和生物素中的一种或几种；优选的，所述其他诱导分化组分包括转铁蛋白、L
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抗坏血酸、亚硒酸钠、乙醇胺、L
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肉毒碱、腐胺、亚油酸和生物素；更优选的，所述转铁蛋白的浓度为10ng/mL～30ng/mL，所述L
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抗坏血酸的浓度为100μg/mL～500μg/mL，所述亚硒酸钠的浓度为10ng/mL～20ng/mL，所述乙醇胺的浓度为1μg/mL～3μg/mL，所述L
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肉毒碱的浓度为1μg/mL～5μg/mL，所述腐胺的浓度为10ng/mL～20ng/mL，所述亚油酸的浓度为0.5μg/mL～2μg/mL，所述生物素的浓度为0.1μg/ml～0.5μg/ml；最优选的，所述转铁蛋白的浓度为20ng/mL，所述L
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抗坏血酸的浓度为300μg/mL，所述亚硒酸钠的浓度为15ng/mL，所述乙醇胺的浓度为2μg/...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆曼，付丽娜，马静，辛文，
申请(专利权)人：北京全式金生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：