一种耐受血液或者血液制品抑制的TaqDNA聚合酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种耐受血液或者血液制品抑制的Taq DNA聚合酶突变体及其应用。首先公开Taq DNA聚合酶突变体在SEQ ID NO.1所示的序列，具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三联体表示：字母

【技术实现步骤摘要】
一种耐受血液或者血液制品抑制的Taq DNA聚合酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
更具体地，涉及一种耐受血液或者血液制品抑制的Taq DNA聚合酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]PCR(Polymerase Chain Reaction)技术是用来放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，自1986年被提出以来，分子生物学及其它相关学科依赖于此技术迅速发展。Taq DNA聚合酶是第一代热稳定性的聚合酶，它解决了大肠杆菌聚合酶耐热性差、每次反应后都要补充的缺点，完成了DNA的自动扩增，使PCR技术变成了一种便利、普遍实用的分子生物学技术。
[0003]随着分子生物学技术的发展，PCR技术已被广泛应用于基因表达、分子克隆、测序、疾病检测和治疗、法医学调查、农业生物学技术等过程中，检测的基因模板可能来自于人体或动物体组织、唾液、粪便、痰液或土壤中，因其模板的复杂性，提取模板往往步骤繁多，操作复杂，也可能会引入污染，造成假阴性或假阳性，对于实验影响很大，因此，用样本作为模板直接进行扩增是逐渐成为较为主流的测试方法。在宏基因组扩增实验中，样品与环境中可能带来一些污染与化学制剂影响，导致扩增效果不理想；另外，血液及组织样品中也存在一些抑制物对聚合酶活性也存在抑制作用，因此，直扩的方法对于DNA聚合酶的抗抑制性有较高的要求，野生型Taq DNA聚合酶在此类PCR实验中表现不稳定。
[0004]Taq DNA聚合酶属于聚合酶家族A，是一个单体酶，全长832个氨基酸，与大肠杆菌聚合酶I有很高的结构同源性。目前野生型Taq DNA聚合酶对于全血的耐受浓度为0.1～1％，它的N端截短体Klentaq对于血液的耐受程度有一定的提升。但是Klentaq的耐受力仍然不能满足直扩试剂盒的需求，因此我们需要对野生型聚合酶进行突变，提升聚合酶对全血的耐受程度。
[0005]酶进化是指利用定向进化技术对工具酶进行改造，旨在提高酶的催化活力、酶的稳定性及对环境的适应能力。定向进化是通过模拟酶在自然界中的进化方法，在核酸序列上引入随机突变，获得突变体文库。通过定向选择的方法，筛选出性质得到优化的目标酶。目前对于突变体文库的筛选主要采用分级筛选法和高通量筛选法，主要采用平板或多孔筛选板为主要筛选工具，常用HPLC测定酶活或酶标仪进行光谱分析进行筛选，筛选通量较小。定向进化的突变文库模拟自然界的进化过程，往往会构将庞大的突变体文库。传统的筛选方式相对于较大的筛选文库意味着巨大的工作量和较低的筛选效率。
[0006]同时，聚合酶更加不适用于上述两种筛选方法。不同于聚合酶，其他催化酶底物与产物成分较为均一，通过荧光光谱可以直接检测底物活性从而检测酶活。聚合酶的底物与产物都不能通过简单的一步法进行测量，所以不能直观得到酶活数据，因此需要特殊的方法对酶活进行检测。分隔式自我复制(Compartmentilized Self
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Replication,CSR)技术是针对聚合酶的高通量筛选技术，主要原理是将聚合酶在大肠杆菌系统中表达出来，采用油
包水乳化液体系将细菌菌体分离，油包水体系中包含有复制所需的缓冲环境与底物，但不另外添加聚合酶与模板，根据聚合酶序列设计引物，使每一个油包水液滴形成一个微型PCR体系。油包水体系分离、分散且稳定，微型体系之间不会相互影响，聚合酶只复制自身的编码基因，形成一个环路反馈。在这个复制过程中，没有活性的突变体酶不能对自我复制进行催化，有催化活性的突变体则将自身DNA通过链式聚合反应指数级放大，在后续的产物收集过程中被富集到。CSR技术的优势在于单次可筛选大量的有活性的聚合酶突变体，其筛选通量可达109个/样品。
[0007]在聚合酶参与的PCR(链式聚合反应)中，常常因为样品及外部环境原因，掺入一些抑制聚合酶的反应物，导致PCR过程不能顺利进行，最终产物量不能满足需求，所以在进行PCR反应前需要对样品进行预处理，如临床血液基因组检测等。因此对于像血液或者血液制品(如血浆)这样特殊的样本直扩对于聚合酶的抗抑制能力有了很高的要求。而目前的CSR技术是在筛选出有活性的聚合酶的基础上，再对以上的抑制物进行耐受的检测，即二次筛选，这就造成了CSR后期的工作强度大大增加。
[0008]因此，需要对CSR技术进行改进以得到对血液或血液制品具有较高抗抑制性的Taq DNA聚合酶突变体。

技术实现思路

[0009]本专利技术的一个目的在于提供耐受血液或者血液制品抑制的Taq DNA聚合酶突变体，其可以耐受较高浓度的血液或血液制品，可直接应用于体外诊断或血液直扩试剂盒中，简化操作步骤。
[0010]本专利技术的另一个目的在于提供上述Taq DNA聚合酶突变体的应用。
[0011]为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0012]本专利技术首先提供了一种耐受血液或者血液制品抑制的Taq DNA聚合酶突变体，所述Taq DNA聚合酶突变体在SEQ ID NO.1所示的序列中，具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三联体表示：字母
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数字
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字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸：Y81H(81位酪氨酸突变为组氨酸)、K82N(82位赖氨酸突变为天冬酰胺)、V310I(310位缬氨酸突变为异亮氨酸)、L619A(619位赖氨酸突变为丙氨酸)。
[0013]本专利技术通过随机突变野生型Taq DNA聚合酶的全长序列，保证每次突变的效率为0.5～1％，通过CSR压力筛选，发现了四个有意义的突变位点Y81H、K82N、V310I、L619A。当四个位点同时突变得到的Taq DNA聚合酶突变体在血液直扩实验中有明显优于野生型Taq DNA聚合酶的表现。本专利技术利用CSR的酶活筛选过程中直接添加压力筛选，并将该筛选压力由CSR先筛选出具有活性的聚合酶后进行表达、纯化后再进行的二次筛选，提前到了CSR过程中对大量的突变体进行酶活和压力筛选同时进行，从而得到了更高的筛选效率与成功率，经改造后的聚合酶可以耐受较高浓度的血液或血液制品，可直接应用于血液直扩PCR试剂盒中，简化操作步骤。
[0014]在本专利技术具体的实施方式中，所述Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或与SEQ ID NO.2所示序列具有80％同一性的具有Taq DNA聚合酶活性的氨基酸序列；优选具有85％同一性，更优选具有90％同一性，最优选的，具有95％同一性。
[0015]本专利技术进一步提供了编码上述Taq DNA聚合酶突变体的核苷酸序列。
[0016]在本专利技术具体的实施方式中，所述Taq DNA聚合酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。需要说明的是，由于同一氨基酸可能有多种不同的密码子来决定，所以编码上述Taq DNA聚合酶突变体的核苷酸序列也可以是由SEQ ID NO.4所示的野生型Taq DNA聚合酶核苷酸序列突变一个本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种耐受血液或者血液制品抑制的Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶突变体在SEQ ID NO.1所示的序列中，具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三联体表示：字母
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数字
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字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸：Y81H、K82N、V310I、L619A。2.根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或与SEQ ID NO.2所示序列具有80％同一性的具有Taq DNA聚合酶活性的氨基酸序列；优选具有85％同一性，更优选具有90％同一性，最优选的，具有95％同一性。3.编码权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐欣，陈相永，宋新文，耿亮，辛文，
申请(专利权)人：北京全式金生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：