突变型DNA聚合酶、编码基因、重组表达载体、重组菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种突变型DNA聚合酶、编码基因、重组表达载体、重组菌及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术的突变型DNA聚合酶，通过在聚合酶结构域的基序I、基序II、基序III的至少两个基序中分别引入一个或多个氨基酸突变，显著提高了突变体酶的逆转录活性、扩增灵敏度和对血液的耐受性。实验结果表明，突变体M13、M14、M16、M17、M19、M20和M22的逆转录活性明显高于野生型Z05DNA聚合酶，逆转录反应时间缩短；同时，突变体M13、M14、M17、M19和M22能够扩增低拷贝RNA(101拷贝)，有利于提高检测灵敏度；在血液耐受性方面，突变体M13、M17和M19的血液耐受性明显提高。血液耐受性明显提高。血液耐受性明显提高。

【技术实现步骤摘要】
突变型DNA聚合酶、编码基因、重组表达载体、重组菌及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种突变型DNA聚合酶、编码基因、重组表达载体、重组菌及其应用。

技术介绍

[0002]聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，不仅可用于基因分离、克隆、核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断、测序等。PCR的基本原理是根据DNA双螺旋模型所建立的体细胞复制的机制以及双链DNA在体外复制的特点设计的，类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。一般情况下，PCR由变性
‑
退火
‑
延伸三个基本反应步骤构成：
①
模板DNA的变性：模板DNA经加热或用变性剂处理一段时间后，双链DNA解离成单链，以便与引物结合，为下轮反应作准备；
②
模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA变性成为单链后，降低温度至引物与模板DNA单链的互补序列配对结合，形成DNA模板
‑
引物结合物；
③<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种突变型DNA聚合酶，其特征在于：所述突变型DNA聚合酶在聚合酶结构域中至少包含以下基序：基序I：E
‑
X
11
‑
E
‑
V
‑
F
‑
R
‑
L
‑
A
‑
G
‑
H
‑
P
‑
F
‑
N
‑
L
‑
N
‑
S
‑
R
‑
D
‑
Q
‑
L
‑
E
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R
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V
‑
L
‑
F
‑
D
‑
E
‑
L
‑
R
‑
L
‑
P
‑
A
‑
X
12
‑
G
‑
K
‑
T
‑
X
13
‑
K，其中，X
11
是谷氨酸或脂肪族类氨基酸，X
12
是亮氨酸或碱性氨基酸，X
13
是谷氨酰胺或碱性氨基酸；基序II：L
‑
S
‑
S
‑
S
‑
X
21
‑
P
‑
N
‑
L
‑
X
22
‑
X
23
‑
I
‑
P
‑
I
‑
R
‑
T，其中，X
21
是天冬氨酸或碱性氨基酸，X
22
是谷氨酰胺或碱性氨基酸，X
23
是天冬酰胺或脂肪族类氨基酸；基序III：S
‑
Q
‑
X
31
‑
L
‑
A
‑
I
‑
P
‑
Y
‑
X
32
‑
E
‑
A
‑
V
‑
A
‑
F
‑
X
33
‑
E
‑
R
‑
Y
‑
F
‑
Q，其中，X
31
是谷氨酸或芳香族类氨基酸，X
32
是谷氨酸或碱性氨基酸，X
33
是异亮氨酸或含硫类氨基酸；所述基序I、基序II、基序III的至少两个基序中，分别存在至少一个氨基酸突变；所述DNA聚合酶为Z05 DNA聚合酶。2.根据权利要求1所述的突变型DNA聚合酶，其特征在于：所述脂肪族类氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸中的任意一种；所述碱性氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸中的任意一种；所述芳香族类氨基酸选自苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸中的任意一种；所述含硫类氨基酸选自半胱氨酸、蛋氨酸中的任意一种；优选地，所述脂肪族类氨基酸选自甘氨酸或亮氨酸；所述碱性氨基酸选自精氨酸或赖氨酸；所述芳香族类氨基酸为酪氨酸；所述含硫类氨基酸为蛋氨酸。3.根据权利要求2所述的突变型DNA聚合酶，其特征在于：所述突变型DNA聚合酶的基序I中，X
11
是谷氨酸或亮氨酸，X
12
是亮氨酸或精氨酸，X
13
是谷氨酰胺或精氨酸；基序II中，X
21
是天冬氨酸或赖氨酸，X
22
是谷氨酰胺或赖氨酸，X
23
是天冬酰胺或甘氨酸；基序III中，X
31
是谷氨酸或酪氨酸，X
32
是谷氨酸或精氨酸，X
33
是异亮氨酸或蛋氨酸。4.根据权利要求1所述的突变型DNA聚合酶，其特征在于：所述突变型DNA聚合酶在聚合酶结构域中至少包含以下基序：基序I：E
‑
E
‑
E
‑
V
‑
F
‑
R
‑
L
‑
A
‑
G
‑
H
‑
P
‑
F
‑
N
‑
L
‑
N
‑
S
‑
R
‑
D
‑
Q
‑
L
‑
E
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R
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V
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L
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F
‑
D
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E
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L
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R
‑
L
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P
‑
A
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X
12
‑
G
‑
K
‑
T
‑
X
13
‑
K，其中，X
12
是亮氨酸(L)或...

【专利技术属性】
技术研发人员：娄双颜，魏喜换，康富帅，
申请(专利权)人：郑州思昆生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：