TthDNA聚合酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及Tth DNA聚合酶突变体及其应用。本发明专利技术提供了具有如SEQ ID No.12所示氨基酸序列或如SEQ ID No.11所示核苷酸序列所编码的Tth DNA聚合酶、具有如SEQ ID No.11所示核苷酸序列的重组质粒以及具有如SEQ ID No.11所示核苷酸序列的重组质粒的菌株。经过进化的Thermus thermophilus热稳定DNA聚合酶在利用碱基类似物底物的DNA片段生物法合成方面具有潜在应用价值，为DNA纳米结构药物载体提供了新的构建方法和实验思路。方法和实验思路。

【技术实现步骤摘要】
Tth DNA聚合酶突变体及其应用
[0001]本申请要求于2022年03月25日提交中国专利局、申请号为202210300630.5、专利技术名称为“Tth DNA聚合酶突变体及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。


[0002]本专利技术涉及生物
，特别涉及Tth DNA聚合酶突变体及其应用。

技术介绍

[0003]Tth DNA聚合酶是来源于嗜热栖热菌Thermus thermophilus的一种分子量为94000道尔顿的单亚基聚合酶，它具有以下两个显著特点：一是耐高温，因为来源于嗜热栖热菌Thermus thermophilus，该酶在70℃条件下能够保持数小时酶活不下降；二是它除了常规的以DNA为模板的DNA聚合酶功能，还有以RNA为模板合成cDNA的反转录酶功能。
[0004]Tth DNA聚合酶最先是从嗜热栖热菌Thermus thermophilus中分离到，它与由水栖嗜热菌Thermus aquaticus产生的TaqDNA聚合酶在氨基酸序列上具有88％的同源性。Tth DNA聚合酶最初是通过天然菌株发酵培养提取，但由于该菌生长的最适温度太高(75℃)，设备负担重而且生长速度极慢，生长密度低，所以有人已采用制备基因文库的办法克隆出该基因，并导入中温性微生物大肠杆菌中进行表达，产酶活力比天然菌株高12倍以上。
[0005]氟尿嘧啶，又名5
‑
氟尿嘧啶，化学式为C4H3FN2O2(如式I所示)，是一种嘧啶类似物，属于抗代谢药的一种，主要用于治疗肿瘤。本品为最常用的尿嘧啶抗代谢药，在体内先经过一系列反应变成氟尿嘧啶脱氧核苷酸，然后发挥效应(影响DNA合成)；尚能在体内转化为氟尿嘧啶核苷掺入RNA，从而干扰蛋白质合成。主要作用在S期，但对其他各期细胞也有一定作用。易透过血脑屏障，易进入脑组织及肿瘤转移灶。约10％～30％原型由尿中排出，约60％～80％在肝内灭活变为CO2和尿素，分别由呼吸道和尿排出。本品抗瘤谱广。
[0006][0007]普通实验中碱基类似物需要经过化学合成引入核酸，因此提供一种通过生物法引入碱基类似物的工具具有重要的现实意义。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术提供了Tth DNA聚合酶突变体及其应用。
[0009]本专利技术的目的在于提供一种热稳定性优良、符合工业应用的需求、具有较大的应用潜力的来源于嗜热栖热菌Thermus thermophilus的热稳定的DNA聚合酶及其定点突变改进的编码基因，并通过定点突变提高DNA聚合酶的热稳定性及利用碱基类似物(5
‑
氟尿嘧
啶)作为底物的能力。
[0010]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0011]本专利技术提供了DNA聚合酶突变体，包括：
[0012]第310位的甘氨酸突变为亮氨酸；和/或
[0013]第427位的赖氨酸突变为精氨酸；和/或
[0014]第507位的赖氨酸突变为精氨酸；和/或
[0015]第637位的甘氨酸突变为丙氨酸；和/或
[0016]第638位的赖氨酸突变为精氨酸。
[0017]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述DNA聚合酶突变体，包括：
[0018](I)、具有如SEQ ID No.12所示的氨基酸序列；和/或
[0019](II)、具有如(I)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(I)所示的氨基酸序列功能相同或相似；和/或
[0020](III)、具有与(I)或(II)任意所示的氨基酸序列至少有80％同源性的氨基酸序列；
[0021]所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个和/或100个。
[0022]在本专利技术的一些具体实施方案中，编码上述DNA聚合酶突变体的核酸分子包括：
[0023](IV)、具有如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；和/或
[0024](V)、具有如(IV)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(IV)所示的核苷酸序列功能相同或相似；和/或
[0025](VI)、具有与(IV)或(V)任意所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
[0026]所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个和/或100个。
[0027]本专利技术还提供了重组载体，包括上述的核酸分子。
[0028]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述重组载体的骨架载体包括细菌表达载体、酵母表达载体、霉菌表达载体和/或哺乳动物表达载体；
[0029]所述酵母表达载体包括pPIC9K。
[0030]本专利技术还提供了宿主，转染或转化上述的重组载体；
[0031]所述宿主，包括菌株和/或细胞株。
[0032]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述菌株包括毕赤酵母菌。
[0033]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述菌株包括细菌、酵母菌和/或霉菌；所述细菌包括大肠杆菌和/或芽孢杆菌。
[0034]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述细胞株包括BHK细胞、CHO细胞和/或HEK293细胞。
[0035]本专利技术还提供了上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.DNA聚合酶突变体，其特征在于，包括：第310位的甘氨酸突变为亮氨酸；和/或第427位的赖氨酸突变为精氨酸；和/或第507位的赖氨酸突变为精氨酸；和/或第637位的甘氨酸突变为丙氨酸；和/或第638位的赖氨酸突变为精氨酸。2.如权利要求1所述的DNA聚合酶突变体，其特征在于，包括：(I)、具有如SEQ ID No.12所示的氨基酸序列；和/或(II)、具有如(I)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(I)所示的氨基酸序列功能相同或相似；和/或(III)、具有与(I)或(II)任意所示的氨基酸序列至少有80％同源性的氨基酸序列；所述多个为2个～100个。3.如权利要求1或2所述的DNA聚合酶突变体，其特征在于，编码所述DNA聚合酶突变体的核酸分子包括：(IV)、具有如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；和/或(V)、具有如(IV)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(IV)所示的核苷酸序列功能相同或相似；和/或(VI)、具...

【专利技术属性】
技术研发人员：王萍，李春明，殷敬华，
申请(专利权)人：上海威高医疗技术发展有限公司，
类型：发明
国别省市：