AMP磷酸转移酶突变体、其编码基因及在ATP合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种AMP磷酸转移酶突变体、其编码基因及在ATP合成中的应用。所述突变体的氨基酸序列由SEQ：ID：NO:1所示序列经过一次或多次突变得来。包含其第124位（A124L）、312位（G312M）、393位（F393K）三个突变位点中一个或多个突变位点。本发明专利技术还提供了包含腺苷激酶和AMP磷酸转移酶突变体的复合生物催化剂以及其在ATP合成中的应用。本发明专利技术突变体酶活性更高、稳定性更高、ATP生成占比更高，固定化后重复批次大于100批，可以进一步降低全酶法生产ATP的成本，且本发明专利技术可以降低酶种类低至2种即可完成整体腺苷磷酸化合成ATP反应，有利于大规模工业化应用。工业化应用。

【技术实现步骤摘要】
AMP磷酸转移酶突变体、其编码基因及在ATP合成中的应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体地说是一种AMP磷酸转移酶突变体、其编码基因及在ATP合成中的应用。

技术介绍

[0002]三磷酸腺苷简称ATP，是一种不稳定的高能化合物，在细胞中与ADP相互转化实现贮能和放能，从而保证了细胞各项生命活动的能量供应。ATP在人体能量代谢中起着重要的作用，作为代谢的中间体、辅酶参与生物体内糖类、蛋白质、核酸和脂肪等的代谢。在临床应用上，对肌肉萎缩、中风后遗症、心肌梗塞、冠状动脉硬化、肝炎等病症具有良好的治疗和辅助治疗作用。
[0003]ATP的合成主要有化学法和生物法，生物法又包括微生物发酵法和生物酶催化法。微生物发酵法是利用酵母菌酶系，以酵母体内酶为催化剂，通过糖酵解、底物水平磷酸化合成ATP。此法虽然生产效果良好，成本低，但存在反应过程复杂，参与催化反应的酶系众多，反应过程不易控制，且产品批次间质量差异较大、分离纯化复杂等问题。
[0004]而生物酶催化法是以生物酶为催化剂，与底物直接接触，底物转化率高，生产成本低，生产过程更加高效稳定、容易控制且节能环保。在原料成本方面，除底物和一定量镁盐等无机盐外，发酵法需消耗大量酵母泥、葡萄糖及磷酸盐，而生物酶法则需要添加一定量的磷酸供体和相应的催化酶即可完成。
[0005]腺苷激酶(Adenosine kinase，AK)属于核糖激酶家族，催化腺苷磷酸化为AMP，也可以ATP为磷酸供体，进行催化反应，AK是腺苷利用合成途径的第一种酶，因此它在调节细胞内和细胞外腺苷水平方面起着关键作用。AMP磷酸转移酶(AMP phosphotransferase，AMP
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PPT)是以多磷酸作为磷酸供体，将AMP磷酸化生成ADP的酶。AMP磷酸转移酶突变体(AMP
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PPTM)是在原有菌株基础上利用PCR技术对其基因进行突变，筛选出酶活性、稳定性、生成的ATP占比高的突变体，从而改变原有的功能，兼具AMP磷酸化合成ADP和ADP磷酸化合成ATP双重功能。
[0006]酶催化法相比发酵法而言，具有高效稳定、反应体系简单、反应过程容易操作等优点。如2001年，Akihiko MARUYAMA等报道了以腺嘌呤为底物，在产氨基酸菌催化作用下合成ATP，反应28h后ATP生成量为70.6mg/mL，底物转化率为82％。专利CN104762347A提出的一种三磷酸腺苷(ATP)的生产方法。此工艺较为复杂，反应过程不易控制，成本较高，酶系活力下降较快，底物腺苷浓度30g/L反应4.5h，腺苷转化率为95.3％，ATP生成量约为42.5g/L，ATP生成率为89.57％，总收率为81.2％。专利CN110777180A公开的“一种固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法”，该方法采用三种酶组合进行固定化，腺苷浓度30g/L，反应6h，经分离纯化得三磷酸腺苷干品445g。反应时间相对较长，酶组合种类多且固定化酶量加入量大在一定程度上提高生产成本。专利CN106191170A公开了一种多酶参与的ATP合成工艺。该工艺以腺苷为底物，采用AK酶、Ppk2酶、AK酶、Pap酶四种酶组合反应合成ATP，底物浓度30g/L，反应8小时，腺苷转化率为85％，ATP生成率为87.71％，生成量约为50g/L，总收率为80％。该工艺
酶组合由四种酶组成，增加了成本，其次随着酶种类增加副反应也会增加给后期分离纯化带来很大的影响，同时酶种类的增加也会使反应受到一定的抑制，从而出现底物转化不完全等一系列问题。
[0007]综上所述，为进一步达到降低生产成本、简化工艺流程、提高底物转化率、提高产品品质且生产工艺环境友好的目的，需研究开发一种活力更好、稳定性更强的催化用酶及更为简单高效的ATP生产新工艺。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的就是提供一种AMP磷酸转移酶突变体、其编码基因及在ATP合成中的应用，以解决现有ATP合成技术存在的酶活力低、酶种类多、成本高、工艺控制难等问题。
[0009]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
[0010](一)AMP
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PPTM酶的选择与进化筛选
[0011]本专利技术提供了一种AMP磷酸转移酶突变体，其为下列任一突变体：
[0012]突变体1，所述突变体1是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第124位的Ala突变为Leu；
[0013]突变体5，所述突变体5是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第124位的Ala突变为Leu、将其第312位的Gly突变为Met；
[0014]突变体6，所述突变体6是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第124位的Ala突变为Leu、将其第177位的Gly突变为Ala；
[0015]突变体7，所述突变体7是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第124位的Ala突变为Leu、将其第393位的Phe突变为Lys；
[0016]突变体8，所述突变体8是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第124位的Ala突变为Leu、将其第177位的Gly突变为Ala、将其第393位的Phe突变为Lys；
[0017]突变体9，所述突变体9是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第124位的Ala突变为Leu、将其第312位的Gly突变为Met、将其第393位的Phe突变为Lys；
[0018]突变体10，所述突变体10是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第177位的Gly突变为Ala、将其第312位的Gly突变为Met、将其第393位的Phe突变为Lys。
[0019]本专利技术还提供了编码上述AMP磷酸转移酶突变体的基因。
[0020]本专利技术选择绿脓杆菌(Paeruginosa pseudomonas)物种，NCBI序列号：553898144为原始序列，通过随机突变后利用活力筛选的方法获得活力较好的正向突变点。对初始筛选活力高的突变体进行累计突变，即将正向突变点通过分子生物学手段叠加以提高原有ATP合成活力。在诸多突变中，筛选到10个代表性正向突变体。在这10个代表性突变体后期的累加实验中发现。其中含有第124位(A124L)、312位(G312M)、393位(F393K)三个突变位点的突变体9可将ATP合成活力提高约80倍，在50℃15min下温度稳定性可提高20倍，可达到单酶高能力合成ATP的效果，重命名为AMP
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PPTM。
[0021](二)复合生物催化剂的制备：复合生物催化剂包括腺苷激酶和上述的AMP磷酸转移酶突变体，优选采用AMP
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PPTM突变体。
[0022]AK酶来源：从酿酒酵母基因组中提取腺苷激酶基因组(GenBank:GHM90234.1)并进行PCR扩增，将回收的酶基因片段连接到pET28a质粒载体上，获得重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种AMP磷酸转移酶突变体，其特征在于，其为下列任一突变体：突变体1，所述突变体1是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第124位的Ala突变为Leu；突变体5，所述突变体5是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第124位的Ala突变为Leu、将其第312位的Gly突变为Met；突变体6，所述突变体6是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第124位的Ala突变为Leu、将其第177位的Gly突变为Ala；突变体7，所述突变体7是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第124位的Ala突变为Leu、将其第393位的Phe突变为Lys；突变体8，所述突变体8是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第124位的Ala突变为Leu、将其第177位的Gly突变为Ala、将其第393位的Phe突变为Lys；突变体9，所述突变体9是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第124位的Ala突变为Leu、将其第312位的Gly突变为Met、将其第393位的Phe突变为Lys；突变体10，所述突变体10是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第177位的Gly突变为Ala、将其第312位的Gly突变为Met、将其第393位的Phe突变为Lys。2.编码权利要求1所述AMP磷酸转移酶突变体的基因。3.一种复合生物催化剂，其特征在于，包含腺苷激酶和权利要求1所述的AMP磷酸转移酶突变体。4.根据权利要求3所述的复合生物催化剂，其特征在于，所述复合生物催化剂是由所述的腺苷激酶和AMP磷酸转移酶突变体...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦浩杰，任丽梅，杨梦茜，张蕴之，米雅萱，王素霞，刘东，高文杲，
申请(专利权)人：美邦美和生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：