一种热启动TaqDNA聚合酶及其制备方法和应用技术

本申请涉及分子诊断的技术领域，具体公开了一种热启动Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用。本申请提供了一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，利用两种酸酐对Taq DNA聚合酶进行双重修饰，得到热启动Taq DNA聚合酶；两种酸酐分别为环己烯

【技术实现步骤摘要】
一种热启动Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用


[0001]本申请涉及分子诊断的
，具体公开了一种热启动Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]PCR是多聚酶链式反应的简称，是体外酶促合成特定DNA片段的一种方法，它能在一个试管内将目的基因或DNA片段在数小时内扩增十万倍至数百万倍。这一技术已经广泛应用于生物学的许多研究领域。随着PCR技术的发展，也暴露出了PCR技术中存在的一些问题，如非特异性扩增产物的出现、引物二聚体的形成、凝胶电泳上无扩增带等，从而限制了PCR技术的应用。热启动PCR技术的问世解决了这些问题，从而使得PCR技术的应用更加完善。
[0003]目前热启动PCR方式主要依赖于热启动的Taq DNA聚合酶，而Taq DNA聚合酶的修饰主要有抗体修饰法、核酸适配体修饰法、化学修饰法。其中，抗体修饰法是一种动态平衡，在冻干和反复冻融过程中，抗体会有一部分从Taq DNA聚合酶上解离下来，从而导致了Taq DNA聚合酶的稳定性较差。核酸适配体修饰后的Taq DNA聚合酶，封闭效率较低，容易在反转录阶段提前释放活性，造成非特异性扩增。另外，抗体和核酸来源于动物或者细胞，用于修饰Taq DNA聚合酶会引入额外的污染。
[0004]化学修饰法通过共价作用修饰Taq DNA聚合酶，获得修饰后的Taq DNA聚合酶。在PCR技术中的热启动阶段，修饰后的Taq DNA聚合酶的热激活过程所需时间较长，从而影响了Taq DNA聚合酶的活性。

技术实现思路

[0005]为了缩短Taq DNA聚合酶的热激活时间，同时保证获得的Taq DNA聚合酶具有较高的封闭效率和较好的稳定性，本申请提供一种热启动Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用。
[0006]第一方面，本申请提供了一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法。
[0007]一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，利用两种酸酐对Taq DNA聚合酶进行双重修饰，得到热启动Taq DNA聚合酶；所述两种酸酐分别为环己烯
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1,2
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二羧酸酐、3,6
‑
二氯
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1,2,4,5
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苯四甲酸二酸酐。
[0008]本申请中，采用环己烯
‑
1,2
‑
二羧酸酐和3,6
‑
二氯
‑
1,2,4,5
‑
苯四甲酸二酸酐对Taq DNA聚合酶进行双重酸酐修饰，得到的热启动Taq DNA聚合酶在37℃时的封闭效率较高；在温度为50℃时前10min的封闭效率较高，之后的热激活时间较短；且稳定性较好，在PCR技术应用中具有优异的扩增效果。由此可知，本申请提供的制备方法能够有效缩短制得的热启动Taq DNA聚合酶的热激活时间。
[0009]经过试验分析可知，相比于单独使用一种酸酐对Taq DNA聚合酶进行修饰，使用两种酸酐对Taq DNA聚合酶进行双重修饰制备得到的热启动Taq DNA聚合酶热激活时间较短，封闭效率较高，稳定性较好。因此，本申请采用两种酸酐对Taq DNA聚合酶进行双重修饰。
[0010]经过试验分析可知，相比于将环己烯
‑
1,2
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二羧酸酐和1,2,4,5
‑
苯四甲酸二酸酐作为两种酸酐或者将柠槺酸酐和3,6
‑
二氯
‑
1,2,4,5
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苯四甲酸二酸酐作为两种酸酐，选择使用环己烯
‑
1,2
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二羧酸酐和3,6
‑
二氯
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1,2,4,5
‑
苯四甲酸二酸酐作为两种酸酐对Taq DNA聚合酶进行双重修饰，制备得到的热启动Taq DNA聚合酶的热激活时间较短，封闭效率较高，稳定性较好。因此，本申请采用了环己烯
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1,2
‑
二羧酸酐和3,6
‑
二氯
‑
1,2,4,5
‑
苯四甲酸二酸酐作为两种酸酐对Taq DNA聚合酶进行双重修饰。
[0011]进一步地，所述热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，具体包括以下步骤：
[0012](1)将所述Taq DNA聚合酶置换到缓冲液中，得到Taq DNA聚合酶溶液；
[0013](2)将所述环己烯
‑
1,2
‑
二羧酸酐溶解在二甲基亚砜中，加入到步骤(1)所述Taq DNA聚合酶溶液中进行振荡反应，得到混合液A；
[0014](3)将所述3,6
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二氯
‑
1,2,4,5
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苯四甲酸二酸酐溶解在二甲基亚砜中，加入到步骤(2)所述混合液A中进行振荡反应，得到混合液B；
[0015](4)对步骤(3)所述混合液B进行G25脱盐到缓冲液中，
‑
20℃冻存得到所述热启动Taq DNA聚合酶。
[0016]本申请提供的技术方案中，先采用环己烯
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1,2
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二羧酸酐对Taq DNA聚合酶进行修饰，之后采用3,6
‑
二氯
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1,2,4,5
‑
苯四甲酸二酸酐对Taq DNA聚合酶进行第二重修饰，通过简单的反应制备得到热启动Taq DNA聚合酶。上述技术方案中所涉及的原料和设备成本较低，操作步骤较简单，无任何外源DNA污染，且能够快速获得热启动Taq DNA聚合酶。
[0017]经过试验分析，相比于先采用1,2,3,4
‑
苯四甲酸二酸酐对Taq DNA聚合酶进行修饰后采用环己烯
‑
1,2
‑
二羧酸酐对Taq DNA聚合酶进行第二重修饰，或者将上述两种酸酐同时对热启动Taq DNA聚合酶进行修饰，先采用环己烯
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1,2
‑
二羧酸酐对Taq DNA聚合酶进行修饰后采用3,6
‑
二氯
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1,2,4,5
‑
苯四甲酸二酸酐对Taq DNA聚合酶进行第二重修饰，制备得到的热启动Taq DNA聚合酶的热激活时间较短，封闭效率较高。因此，本申请先采用环己烯
‑
1,2
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二羧酸酐对Taq DNA聚合酶进行修饰，之后采用3,6
‑
二氯
‑
1,2,4,5
‑
苯四甲酸二酸酐对Taq DNA聚合酶进行第二重修饰。
[0018]进一步地，所述Taq DNA聚合酶、所述环己烯
‑
1,2
‑
二羧酸酐与所述3,6
‑
二氯
‑
1,2,4,5
‑
苯四甲酸二酸酐的重量比为5：(30
‑
70)：(30<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，利用两种酸酐对Taq DNA聚合酶进行双重修饰，得到热启动Taq DNA聚合酶；所述两种酸酐分别为环己烯
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1,2
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二羧酸酐、3,6
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二氯
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1,2,4,5
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苯四甲酸二酸酐。2.根据权利要求1所述的热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：（1）将所述Taq DNA聚合酶置换到缓冲液中，得到Taq DNA聚合酶溶液；（2）将所述环己烯
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1,2
‑
二羧酸酐溶解在二甲基亚砜中，加入到步骤（1）所述Taq DNA聚合酶溶液中进行振荡反应，得到混合液A；（3）将所述3,6
‑
二氯
‑
1,2,4,5
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苯四甲酸二酸酐溶解在二甲基亚砜中，加入到步骤（2）所述混合液A中进行振荡反应，得到混合液B；（4）对步骤（3）所述混合液B进行G25脱盐到缓冲液中，
‑
20℃冻存得到所述热启动Taq DNA聚合酶。3.根据权利要求2所述的热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶、所述环己烯
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1,2
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二羧酸酐与所述3,6
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二氯
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1,2,4,5
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苯四甲酸二酸酐的重量比为5：（30
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70）：（30

【专利技术属性】
技术研发人员：许秀丽，张望，周建平，周裕军，
申请(专利权)人：北京丹大生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：