一个具有高催化活性的Ppmar1转座酶L477A-L479A突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶L477A

【技术实现步骤摘要】
一个具有高催化活性的Ppmar1转座酶L477A
‑
L479A突变体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶L477A
‑
L479A突变体及其应用。
[0002]
技术介绍

[0003]转座子（transposon）是指在基因组上能从一个位点转移到另一个位点的一段DNA序列。自转座子被发现以来，随着人们在分子水平上对转座子结构和功能认识的不断深化，一些转座子已被改造为基因标签应用于基因分析，并逐渐成为大规模分离基因的重要手段之一。
[0004]Mariner
‑
Like转座子（Mariner
‑
Like Elements，MLE）是转座子中一个重要家族，最早是在研究毛里塔尼亚果蝇(Drosophila mauristiana) 白眼基因的一个不稳定突变时发现的。此后在其他动物以及植物基因组中也发现了大量MLE转座子的存在。与其它转座子相比较，MLE转座子具有结构简单、异源转座率高、在基因组插入位点接近随机等特点，在开发基因标签，分离基因，研究基因功能上，远远优于其他转座子。
[0005]MLE转座子由两端反向重复序列（Terminal Inverted Repeats，TIRs）和编码转座酶的基因组成，转座酶负责催化转座子转座，因此转座酶的活性是影响转座子的转座频率的主要因素。然而自然界分离的MLE转座酶由于在进化过程中
ꢀ“
垂直失活”效应积累了或多或少的突变，部分或全部丧失了催化转座能力，成为低活性或非活性的转座酶，严重影响了MLE转座子的应用，因此人工构建高活性的转座酶就显得十分重要。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶L477A
‑
L479A突变体及其应用，解决了现有自然界分离的MLE转座酶催化活性较低或者不具备催化活性的问题。
[0007]本专利技术提供了一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶L477A
‑
L479A突变体，所述的Ppmar1转座酶L477A
‑
L479A突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术还提供了一种编码所述Ppmar1转座酶L477A
‑
L479A突变体的基因，编码所述Ppmar1转座酶L477A
‑
L479A突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]本专利技术还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带有编码所述Ppmar1转座酶L477A
‑
L479A突变体的基因。
[0010]本专利技术还提供了一种工程菌株，所述工程菌株携带有上述重组质粒。
[0011]本专利技术还提供了一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶L477A
‑
L479A突变体在构建酵母突变体中的应用。
[0012]与现有技术相比，本专利技术提供的一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶L477A
‑
L479A突变体，具有以下有益效果：
本专利技术从毛竹（Phyllostachys pubescens）中克隆到的活性转座酶，对其进行人工改造之后获得较高活性的MLE转座酶突变体（Ppmar1转座酶L477A
‑
L479A突变体），Ppmar1转座酶L477A
‑
L479A突变体催化转座子转座的活性是野生型转座酶的活性的2.96倍，为利用MLE转座子开发基因标签奠定了基础，为后基因组时代大规模分离和标记基因，研究基因的功能提供了新工具。
[0013]具体实施方式
[0014]下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细说明，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，如Sambrook等主编的《分子克隆实验指南》中所述条件，或按照试剂盒陈述的步骤进行操作，由于不涉及专利技术点，故不对其步骤进行详细描述。
[0015]当实施例给出数值范围时，应理解，除非本专利技术另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本专利技术中使用的所有技术和科学术语与本
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
的技术人员对现有技术的掌握及本专利技术的记载，还可以使用与本专利技术实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本专利技术。
[0016]一、野生型MLE转座酶和去除转座酶的非自主性转座子的获得步骤1.1，采集新鲜的毛竹叶片（Phyllostachys pubescens），采集于浙江农林大学植物园，北纬N30
°
15
′
14.67
″ꢀ
东经E119
°
43
′
33.47
″
），利用CTAB法提取毛竹基因组DNA，根据MLE转座子TIR保守序列设计引物Ppmar1
‑5‑
3（Ppmar1
‑5‑
3的序列信息见表1），进行PCR扩增，得到MLE转座子扩增产物。
[0017]PCR扩增的体系为20
µ
l，包括0.2
µ
l rTaq Polymerase (5 U/
µ
l)，1
µ
l Ppmar1
‑5‑
3 (10
µ
mol/L)，2
µ
l 10
×
rTaq Buffer（Mg
2+ plus），1.6
µ
l dNTP mix (2.5 mmol/L)，100 ng毛竹基因组DNA，加无菌水补齐 20
µ
l。
[0018]PCR扩增的反应条件为：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 40 s，35 个循环；72 ℃ 2 min，4 ℃ 10 min。
[0019]步骤1.2，扩增出序列后，采用TaKaRa公司pMD
™
18
‑
T Vector Cloning Kit试剂盒的方法将步骤1.1的MLE转座子扩增产物连接到pMD18
‑
T载体，测序确认后，命名为Ppmar1转座子。
[0020]步骤1.3，采用QIAGEN公司的 RNeasy Mini Kit试剂盒提取毛竹叶片RNA，通过Invitrogen公司 的SuperScript
™ꢀ
VILO
™ꢀ
cDNA Synthesis Kit试剂盒将RNA反转录为cDNA，根据Ppmar1转座酶序列设计一对引物PpTpase1
‑
5和PpTpase1
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶L477A
‑
L479A突变体，其特征在于，所述的转座酶L477A
‑
L479A突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种编码所述Ppmar1转座酶L477A
‑
L479A突变体的基因，其特征在于，编码所述转座酶L477A
‑
L479A突变体的基因的核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：周明兵，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：