一个具有高催化活性的Ppmar1转座酶L479A突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶L479A突变体，所述的Ppmar1转座酶L479A突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码所述Ppmar1转座酶L479A突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。是将野生型Ppmar1转座酶479位置上的亮氨酸突变为丙氨酸。该Ppmar1转座酶L479A突变体催化转座子转座的活性是野生型转座酶的活性的2.48倍，为利用MLE转座子开发基因标签奠定了基础，为后基因组时代大规模分离和标记基因，研究基因的功能提供了新工具。能提供了新工具。

【技术实现步骤摘要】
一个具有高催化活性的Ppmar1转座酶L479A突变体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶L479A突变体及其应用。
[0002]
技术介绍

[0003]转座子（transposon）是指在基因组上能从一个位点转移到另一个位点的一段DNA序列。自转座子被发现以来，随着人们在分子水平上对转座子结构和功能认识的不断深化，一些转座子已被改造为基因标签应用于基因分析，并逐渐成为大规模分离基因的重要手段之一。
[0004]Mariner
‑
Like转座子（Mariner
‑
Like Elements，MLE）是转座子中一个重要家族，最早是在研究毛里塔尼亚果蝇(Drosophila mauristiana) 白眼基因的一个不稳定突变时发现的。此后在其他动物以及植物基因组中也发现了大量MLE转座子的存在。与其它转座子相比较，MLE转座子具有结构简单、异源转座率高、在基因组插入位点接近随机等特点，在开发基因标签，分离基因，研究基因功能上，远远优于其他转座子。
[0005]MLE转座子由两端反向重复序列（Terminal Inverted Repeats，TIRs）和编码转座酶的基因组成，转座酶负责催化转座子转座，因此转座酶的活性是影响转座子的转座频率的主要因素。然而自然界分离的MLE转座酶由于在进化过程中“垂直失活”效应积累了或多或少的突变，部分或全部丧失了催化转座能力，成为低活性或非活性的转座酶，严重影响了MLE转座子的应用，因此人工构建高活性的转座酶就显得十分重要。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶L479A突变体及其应用，解决了现有自然界分离的MLE转座酶催化活性较低或者不具备催化活性的问题。
[0007]本专利技术提供了一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶L479A突变体，所述的Ppmar1转座酶L479A突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术还提供了一种编码所述Ppmar1转座酶L479A突变体的基因，编码所述Ppmar1转座酶L479A突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]本专利技术还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带有编码所述Ppmar1转座酶L479A突变体的基因。
[0010]本专利技术还提供了一种工程菌株，所述工程菌株携带有上述重组质粒。
[0011]本专利技术还提供了一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶L479A突变体在构建酵母突变体中的应用。
[0012]与现有技术相比，本专利技术提供的一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶L479A突变体，具有以下有益效果：本专利技术从毛竹（Phyllostachys pubescens）中克隆到的活性转座酶，对其进行人
72 ℃ 40 s，35 个循环；72 ℃ 2 min，4 ℃ 10 min。
[0034]同时，将载体pWL89a用XhoⅠ酶切（酶切位点位于ADE2基因内），回收载体pWL89a骨架。酶切体系为50
µ
l，包括5
µ
l 10
×
buffer，1
µ
l Xho
Ⅰꢀ
(1U/
µ
l), 1
µ
g 载体pWL89a，加无菌水补齐 50
µ
l，37 ℃温浴6小时。
[0035]然后用In
‑
Fusion Advantage PCR Cloning Kit（TaKaRa公司，日本）将Ppmar1NA扩增产物插入到载体pWL89a骨架的ADE2基因中，导致报告基因ADE2插入失活，得到pWL89a
‑
Ppmar1NA重组质粒，即为Ppmar1非自主转座子供体载体。若Ppmar1NA发生转座从ADE2基因上离开，那么ADE2基因阅读框得到回复。该载体具有URA3筛选标记，使导入pWL89a
‑
Ppmar1NA的宿主能够在缺乏Ura（尿嘧啶）的缺失培养基上生长。
[0036]三、Ppmar1转座酶L479A突变体的获得将Ppmar1转座酶核苷酸序列与其他植物MLE转座酶的核苷酸序列进行同源性比对，选取Ppmar1转座酶核苷酸序列479位置上的亮氨酸开展突变，计划将它突变为丙氨酸（L479A）。
[0037]步骤3.1，根据QuikChange
™ꢀ
Site
‑
Directed Mutagenesis Kit（Stratagene公司，美国）试剂盒说明书，设计定点突变引物L479A
‑
F和L479A
‑
R（L479A
‑
F和L479A
‑
R的序列信息见表1），按照QuikChange
™
Site
‑
Directed Mutagenesis Kit试剂盒方法，以步骤2.1的重组质粒pAG413
‑
gal
‑
Tpase为模板，利用PfuTurbo
™ꢀ
DNA polymerase重新合成含有Ppmar1转座酶L479A突变体的质粒DNA；步骤3.2，然后在合成的质粒DNA中加入2 μL的Dpn I限制性内切酶，于37 ℃条件下反应5 min，将原始模板序列彻底降解。将新合成的质粒DNA测序确认后得到Ppmar1转座酶L479A突变体；Ppmar1转座酶L479A突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述Ppmar1转座酶L479A突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0038]四、转座酶活性的检测实验组是将步骤3.2的含有Ppmar1转座酶L479A突变体的质粒DNA和步骤2.2的pWL89a
‑
Ppmar1NA重组质粒，用PEG/LiAc法共同转化到酵母中，用His/ Ura双缺固体培养基上进行选择培养。用半乳糖诱导转座酶表达，促使非自主转座子发生转座。
[0039]以野生型Ppmar1转座酶为对照组，步骤2.1的带有野生型的Ppmar1转座酶的重组质粒pAG413
‑
gal
‑
Tpase和步骤2.2的pWL89a
‑
Ppmar1NA重组质粒，用PEG/LiAc法共同转化到酵母中，用His/ Ura双缺固体培养基上进行选择培养。用半乳糖诱导转座酶表达，促使非自主转座子发生转座。
[0040]实验组和对照组的经诱导培养的酵母用缺失His/Ura/Ade固体培养基上进行选择培养，计算培养基上长出的酵母菌斑。如果转座发生，pWL89a
‑
Ppmar1NA重组质粒上的ADE2基因就能表达，因此阳性酵母株能够在缺乏腺嘌呤的培养基上生长。
[0041]以野生型Ppmar1转座酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶L479A突变体，其特征在于，所述的转座酶L479A突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种编码所述Ppmar1转座酶L479A突变体的基因，其特征在于，编码所述转座酶L479A突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：周明兵，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：