一种吡哆醛激酶突变体及其在磷酸吡哆醇合成中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种吡哆醛激酶突变体及其在磷酸吡哆醇合成中的应用，属于酶工程领域。所述突变体由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一次或多次突变得来，其中，含有第51位（N51K）、第175位（V175E）为突变体1，含有第51位（N51K）、第152位(D152E)为突变体2，含有第51位（N51K）为突变体3。本发明专利技术还提供了包含任一吡哆醛激酶突变体基因的重组质粒、重组菌株以及酶的表达方法和其在磷酸吡哆醇制备中的应用。较野生型吡哆醛激酶，本发明专利技术所述吡哆醛激酶突变体具有较高的催化效率，其中，突变体3酶活较野生型提高了23.3倍，将其用于合成磷酸吡哆醇，可在2

【技术实现步骤摘要】
一种吡哆醛激酶突变体及其在磷酸吡哆醇合成中的应用


[0001]本专利技术属于酶工程领域，具体涉及一种吡哆醛激酶突变体及其在磷酸吡哆醇合成中的应用。

技术介绍

[0002]维生素 B6（Vitamin B6，VB6）是一类可以相互转换的吡啶类化合物的总称，包括吡哆醇（Pyridoxine，PN）、吡哆胺（Pyridoxamin，PM）、吡哆醛（Pyridoxal，PL）。它们所对应的磷酸酯形式为磷酸吡哆醇（Pyridoxine
‑5’‑
phosphate,PNP）、磷酸吡哆胺（Pyridoxamine
‑5’‑
phosphate, PMP）和磷酸吡哆醛（Pyridoal
‑5’‑
phos phate, PLP）。
[0003]PLP 是细胞内140多种酶的辅酶。目前，PLP的生产多采用化学法，中国专利CN 110016049A公开了一种化学方法制备磷酸吡哆醛的方法，不仅耗时耗能、污染严重、成本高，而且其收率低。在生物体内，PLP不能由生物体直接合成，常常是由各种形式的 VB6 通过代谢转换途径完成其合成。PNP作为PLP的前体物，在生物体内是磷酸吡哆醛的一种重要来源。因此，将PNP一步氧化为PLP是生物法制备PLP的一种重要途径。中国专利CN202110644237公开了一种两步法生产PLP的方法，其第一步也是先通过维生素B6经过磷酸转移酶催化生成PNP，但最终PNP的生成率不高。
[0004]宋士娜等记载吡哆醛激酶（pyridoxal kinasePLK）是维生素 B6（VB6）的关键代谢酶，PLK可以将PN磷酸化生成 PNP（宋士娜,王廷华.吡哆醛激酶研究进展[J].四川解剖学杂志,2010,18(04):38
‑
42.）。因此，要提高PNP的生成率，并进一步增加PLP的产量，我们需要开发一种催化效率高的吡哆醛激酶以及高效生产PNP的工艺路线。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的就是提供一种吡哆醛激酶突变体及其在磷酸吡哆醇合成中的应用，以解决现有吡哆醛激酶催化效率低的问题。
[0006]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种吡哆醛激酶突变体，其为下列任一突变体：突变体1，所述突变体1是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型吡哆醛激酶基础上，将其第51位的Asn突变成Lys、第175位的Val突变成Glu得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；突变体2，所述突变体2是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型吡哆醛激酶基础上，将其第51位的Asn突变成Lys、第152位的Asp突变成Glu得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；突变体3，所述突变体3是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型吡哆醛激酶基础上，将其第51位的Asn突变成Lys得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；其中，野生型吡哆醛激酶编码基因PDXK密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]本专利技术还提供了编码上述吡哆醛激酶突变体的核苷酸序列：编码突变体1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；编码突变体2的核苷酸序列如SEQID NO.6所示；编码突变体3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0008]上述吡哆醛激酶突变体的获得方法及突变位置见表1。
[0009]表1 野生型与突变体突变位置及获得方法进一步地，本专利技术提供了包含上述任一吡哆醛激酶突变体编码基因的重组表达载体。
[0010]优选地，所述重组表达载体以pET
‑
29a（+）为原始表达载体。
[0011]更进一步地，本专利技术还提供了包含所述重组载体的重组菌。
[0012]优选地，所述宿主菌为Escherichia coliBL21(DE3)。
[0013]其中，重组菌的构建方法如下：1）将上述任一吡哆醛激酶突变体的编码基因片段插入原始表达载体pET
‑
29a(+)的NdeI和EcoRI酶切位点之间得到重组载体；2）将重组载体通过热击法转化至Escherichia coliBL21(DE3)中，即得重组菌。
[0014]上述吡哆醛激酶突变体在合成磷酸吡哆醇中的应用。
[0015]具体地，在搅拌条件下，将底物VB6加入到盛有一定量纯水的转化罐中，再分别加入镁盐、ATP钠盐、六偏磷酸钠，升温37℃并搅拌溶解，然后用氢氧化钠调节反应pH至5
‑
6，加入吡哆醛激酶突变体酶液以及聚磷激酶（PpK）酶液，定容，于36
‑
40℃条件下进行催化反应合成磷酸吡哆醇。
[0016]优选的，VB6、镁盐、ATP钠盐与六偏磷酸钠的质量比为5：1：5：5。
[0017]优选的，所述镁盐为六水氯化镁。
[0018]优选的，所述反应pH为5，催化反应温度为37℃。
[0019]优选的，每1升体系中，加入1400U
‑
5600U吡哆醛激酶突变体酶液以及800U
‑
1340U聚磷激酶酶液；更优选的，每1升体系中，加入1400 U吡哆醛激酶突变体酶液以及800 U聚磷激酶酶液。
[0020]合成体系中，吡哆醛激酶突变体酶液通过催化VB6，生成磷酸吡哆醇，反应2
‑
5h即可达到99.8%以上的转化率。
[0021]本专利技术还提供一种催化VB6合成磷酸吡哆醇的制剂，所述制剂中含有本专利技术所述吡哆醛激酶突变体。
[0022]本专利技术的有益效果：本专利技术在传统化学合成法与生物酶法的基础上，经过分子改造，设计出了一种吡
哆醛激酶突变体，与野生型吡哆醛激酶相比，该酶具有较高的催化效率。以VB6为底物，通过特定的催化工艺，可用于合成磷酸吡哆醇，并在2
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5 h内实现99.8%以上的转化率。较之前化学合成法与生物酶法，反应时间更短，成本更低，具有良好的工业应用前景。
附图说明
[0023]图1是吡哆醛激酶突变体工程菌构建成功的琼脂糖凝胶电泳图。其中，M为DNA Marker；1号为重组质粒pET29a
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PDXK
‑
M3。
[0024]图2是吡哆醛激酶突变体工程菌发酵诱导表达后SDS
‑
PAGE电泳图。其中，M为蛋白Marker；1号为阴性对照菌；2号为诱导后样品。
[0025]图3是吡哆醛激酶突变体催化合成磷酸吡哆醇前底物与产物的液相检测色谱图。
[0026]图4是吡哆醛激酶突变体催化合成磷酸吡哆醇结束底物与产物的液相检测色谱图。
具体实施方式
[0027]下面实施例用于进一步详细说明本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。在下述实施例中未详细描述的过程和方法是本领域公知的常规方法，实施例中所用试剂均可市购或通过本领域普通技术人员熟知的方法制备。下述实施例均实现了本专利技术的目的。
[0028]序列说明SE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种吡哆醛激酶突变体，其特征在于，其为下列任一突变体：突变体1，所述突变体1是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型吡哆醛激酶基础上，将其第51位的Asn突变成Lys、第175位的Val突变成Glu得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；突变体2，所述突变体2是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型吡哆醛激酶基础上，将其第51位的Asn突变成Lys、第152位的Asp突变成Glu得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；突变体3，所述突变体3是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型吡哆醛激酶基础上，将其第51位的Asn突变成Lys得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。2.根据权利要求1所述一种吡哆醛激酶突变体，其特征在于，编码突变体1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码突变体2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，编码突变体3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。3.表达权利要求1所述任一吡哆醛激酶突变体的重组菌，其特征在于，所述重组菌的原始表达载体为pET<...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁海龙，任丽梅，韩中博，穆玉敏，张彦青，裴红硕，王亮，刘东，高文杲，
申请(专利权)人：美邦美和生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：