核糖激酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种核糖激酶突变体及其在合成核糖

【技术实现步骤摘要】
核糖激酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种大肠杆菌(E.coli BL21DE3)来源的核糖激酶E.coli
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RK突变体及其在合成中的应用。

技术介绍

[0002]核糖
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磷酸是合成许多核苷酸的关键中间体，对于NMN的生物酶法合成至关重要。最近的研究表明，NMN可增强NAD
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生物合成并改善各种症状，例如糖尿病和血管功能障碍。有研究发现NMN可改善小鼠的二型糖尿病的症状,并且无其他毒副作用。由于发现有这些药用效果，NMN已经作为营养品开始出现在市场上。目前，核苷酸化合物如NMN主要通过化学法进行合成，需要使用昂贵的底物和催化剂，而微生物发酵方法的特点是生产力低，缺乏实用性，因此，通过提高关键酶的活性提高NMN产量的酶催化法的优势更为显著。
[0003]与化学催化剂相比，酶作为绿色天然生物催化剂，在催化化学反应中具有优越的立体选择性和区域选择性等优点，且反应条件温和、环境友好，无需苛刻的反应设备。由于产物核糖
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磷酸易被大肠杆菌的背景酶降解，且在一定范围内随着温度升高，核糖
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磷酸降解率越高。本专利采用温度适中的酶催化合成法合成核糖
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磷酸。但在该路线合成核糖
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磷酸过程中，存在核糖激酶E.coli
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RK，活力较低、稳定性差、底物产物抑制等问题，亟需对酶分子实施分子改造。
[0004]本专利通过一步反应直接合成核糖
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磷酸，通过核糖激酶(GenBank:EFH2707387.1)催化核糖和ATP
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二钠合成核糖
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磷酸，以ATP为探针成功构建一种核糖激酶的高通量筛选方法，并筛选出酶活比原始菌株提高了24％
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104％的突变菌株E.coli
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RKA206T、E.coli
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RKV8I、E.coli
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RKE192T和E.coli
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RKE192H。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种酶活较高的核糖激酶突变体，以实现核糖
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磷酸的合成，以核糖为底物，通过核糖激酶催化合成核糖
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磷酸。本专利技术提供的核糖激酶系列突变体及利用该核糖激酶突变体基因重组菌及其粗酶液作为生物催化剂，用于核糖
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磷酸的生物催化合成，突变菌酶活较原始菌提高24％
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104％，底物核糖浓度为30g/L时，底物核糖在反应1h后，转化率达99％。
[0006]ATP具有很强的荧光吸收，ATPi是一种荧光蛋白，其与ATP接触后增强荧光值，并且在0.0001
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0.25mM浓度范围内呈线性关系，通过以底物ATP的减少量使得荧光值降低为信号建立高通量筛选方法，并应用到核糖激酶的筛选中，本专利技术筛选到E.coli
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RKV8I、E.coli
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RKE192T、E.coli
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RKE192H和E.coli
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RKA206T，各个单突变体的酶活提高了24％
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104％。其中突变体E.coli
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RKA206T催化活性最高，该突变体酶活提高了1.04倍，进一步分析了突变体催化性能提升的分子机理，优化反应工艺参数，构建E.coli
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RKA206T催化合成核糖
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磷酸工艺。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0008]第一个方面，本专利技术提供一种核糖激酶突变体，所述核糖激酶突变体由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列进行以下一个或两个以上位点的突变得到：(1)第8位缬氨酸突变为异亮氨酸；(2)第192位谷氨酸突变为苏氨酸或组氨酸；(3)第206位丙氨酸突变为苏氨酸。
[0009]在本专利技术的实施例中，所述核糖激酶突变体由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列进行以下三个位点的突变得到：第8位缬氨酸突变为异亮氨酸；第192位谷氨酸突变为组氨酸；且第206位丙氨酸突变为苏氨酸。
[0010]第二个方面，本专利技术提供一种上述核糖激酶突变体的表达质粒。
[0011]进一步，所述表达质粒的载体为pET28a。
[0012]具体地，所述表达质粒按如下方法构建：以E.coli BL21(DE3)的基因组为模板，以引物RKFF和RKFR进行PCR扩增，得到核糖激酶的线性化片段；以pET28a(+)为模板，以引物28aXF和28aXR进行PCR扩增，得到线性化质粒；以C115酶对所述核糖激酶的线性化片段和所述线性化质粒进行同源重组，得到所述表达质粒；
[0013]TTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATATGCAAAACGCAGGCARKFF GCCTCGT
[0014]ATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAATGATGATGRKFR：ATGGTGGTGC
[0015]28aXF：CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGC
[0016]28aXR：ATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAA。
[0017]第三个方面，本专利技术提供一种过表达所述核糖激酶突变体的基因工程菌。
[0018]进一步，所述基因工程菌株的宿主菌为E.coli BL21(DE3)。
[0019]第四个方面，本专利技术还提供一种所述核糖激酶突变体在催化合成核糖
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磷酸的应用。
[0020]具体地，所述的应用为：以所述核糖激酶突变体为催化剂，以核糖和ATP
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二钠为底物，以pH 7.5、50mM的磷酸盐缓冲液为反应介质构成转化体系，在37℃、800rpm下进行反应，制备核糖
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磷酸。
[0021]进一步，所述核糖激酶突变体可以表达所述核糖激酶突变体的基因工程菌湿菌体、表达核糖激酶突变体的基因工程菌湿菌体的细胞破碎液或所述烟酰胺核糖基转移酶突变体的基因工程菌湿菌体经细胞破碎、蛋白纯化后分离出的纯酶液的形式加入。
[0022]在本专利技术的一个实施例中，所述核糖激酶突变体以表达所述核糖激酶突变体的基因工程菌湿菌体的形式加入，所述催化剂的用量以所述湿菌体的干重计为0.5～2g DCW/L(转化体系)。
[0023]进一步，所述转化体系中，所述核糖的终浓度为15
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30g/L，所述ATP
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二钠的终浓度为55.1
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110.2g/L。
[0024]进一步，所述转化体系还包括终浓度为15
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30mM(优选20mM)的氯化镁。
[0025]更进一步，所述转化体系还包括终浓度为200
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核糖激酶突变体，其特征在于所述核糖激酶突变体由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列进行以下一个或两个以上位点的突变得到：(1)第8位缬氨酸突变为异亮氨酸；(2)第192位谷氨酸突变为苏氨酸或组氨酸；(3)第206位丙氨酸突变为苏氨酸。2.如权利要求1所述的核糖激酶突变体，其特征在于：所述核糖激酶突变体由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列进行以下三个位点的突变得到：第8位缬氨酸突变为异亮氨酸；第192位谷氨酸突变为组氨酸；且第206位丙氨酸突变为苏氨酸。3.如权利要求1所述的核糖激酶突变体的表达质粒。4.过表达如权利要求1所述的核糖激酶突变体的基因工程菌。5.如权利要求1所述的核糖激酶突变体在催化合成核糖
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磷酸的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用为：以所述核糖激酶突变体为催化剂，以核糖和ATP
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二钠为底物，以pH 7.5、50mM的磷酸盐缓冲液为反应介质构成转化体系，在37℃、800rpm下进行反应，制备核糖
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磷酸。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述核糖激酶突变体以表达所述核糖激酶突变体的基因工程菌湿菌体的形式加入，所述催化剂的用量以所述湿菌体的干重计为0.5～...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚平，彭凤，沈其，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：