核酸引导的切口酶编辑中的gRNA稳定制造技术

本公开内容提供了用于活细胞中核酸引导的切口酶/逆转录酶融合编辑的物质组合物、方法和仪器。使用保留核酸引导的核酸酶的某些特征(例如，结合特异性和以靶向方式裂解一个或更多个DNA链的能力)联合逆转录酶活性的融合蛋白(例如，切口酶

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】ID No:2；SEQ ID No:3；SEQ ID No:4；SEQ ID No:5；SEQ ID No:6；SEQ ID No:7；SEQ ID No:8；SEQ ID No:9；SEQ ID No:10；SEQ ID No:11；SEQ ID No:12；SEQ ID No:13；SEQ ID No:14；SEQ ID No:15；SEQ ID No:16；SEQ ID No:17；SEQ ID No:18；SEQ ID No:19；SEQ ID No:20；SEQ ID No:21；SEQ ID No:22；SEQ ID No:23；SEQ ID No:24；SEQ ID No:25；SEQ ID No:26；SEQ ID No:27；SEQ ID No:28；SEQ ID No:29；SEQ ID No:30；SEQ ID No:31；SEQ ID No:32；SEQ ID No:33；SEQ ID No:34；SEQ ID No:35；SEQ ID No:36；SEQ ID No:37；SEQ ID No:38；SEQ ID No:39；SEQ ID No:40；SEQ ID No:41；SEQ ID No:42；SEQ ID No:43；SEQ ID No:44；SEQ ID No:45；SEQ ID No:46；SEQ ID No:47；SEQ ID No:48和SEQ ID No:49。在一些方面，RNA稳定部分是RNA发夹；并且在一些方面，RNA发夹选自SEQ ID No:50；SEQ ID No:51；SEQ ID No:52；SEQ ID No:53；SEQ ID No:54；SEQ ID No:55；SEQ ID No:65；SEQ ID No:66；SEQ ID No:67；SEQ ID No:68；SEQ ID No:69和SEQ ID No:70。在一些方面，RNA稳定部分是RNA假结，其中RNA假结选自SEQ ID No:50；SEQ ID No:56；SEQ ID No:57；SEQ ID No:58；SEQ ID No:59；SEQ ID No:60；SEQ ID No:61；SEQ ID No:62；SEQ ID No:63和SEQ ID No:64。在一些方面，RNA稳定部分是外切核糖核酸酶抗性RNA，并且在一些方面，外切核糖核酸酶抗性RNA选自SEQ ID No:71；SEQ ID No:72和SEQ ID No:73。
[0013]在一些方面，CREATE融合编辑盒具有长度为0至20个核苷酸的接头区。在一些方面，CREATE融合编辑盒具有长度为0至20个核苷酸的引物结合区。在一些方面，CREATE融合编辑盒具有长度为0至20个核苷酸的切口至编辑区。在一些方面，CREATE融合编辑盒具有长度为3至20个核苷酸的编辑后同源性区。在一些方面，CREATE融合编辑盒具有能够与基因组靶基因座杂交的引导序列和能够与核酸引导的核酸酶相互作用或复合的支架序列。
[0014]下面更详细地描述本专利技术的这些方面和其他特征和优势。
[0015]附图简述
[0016]从以下结合附图对说明性实施方案的详细描述，将更充分地理解本专利技术的前述和其他特征和优点，在附图中：
[0017]图1A是用于经由核酸引导的切口酶/逆转录酶融合(“切口酶
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RT融合”)编辑来编辑活细胞的示例性方法的简化框图。图1B是用于经由切口酶
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RT融合编辑来编辑活细胞的示例性方法的可选简化框图。图1C是核酸引导的切口酶/逆转录酶融合蛋白(切口酶
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RT融合物)和CF编辑盒的简化图解描绘。图1D是核酸引导的切口酶/逆转录酶融合蛋白(切口酶
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RT融合物)和CF编辑盒的简化图解描绘，CF编辑盒包含gRNA和修复模板，修复模板在修复模板的3
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端包含RNA稳定部分(这里是G2四联体、发夹、假结)(即“3
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保护的CF编辑盒”或“稳定的CF编辑盒”或“StCFEC”)。图1E示出了作为RNA稳定部分测试的一般假结结构的描绘。
[0018]图2A
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图2C描绘了用于进行切口酶
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RT融合编辑的示例性自动化多模块细胞处理仪器的三个不同视图。
[0019]图3A
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图3C描绘了包含在用于培养和转染细胞用于进行切口酶
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RT融合编辑的集成仪器中的生物反应器模块的示例性实施方案的各种视图和部件(component)。图3D和图3E描绘了用于培养和转染细胞用于进行切口酶
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RT融合编辑的示例性集成仪器。
[0020]图4A描绘了采用细胞的微载体分区递送用于对在悬浮液中生长的哺乳动物细胞进行切口酶
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RT融合编辑的示例性工作流程。图4B描绘了用于培养、传代、转染和编辑iPSC(诱导多能干细胞)的选择，包括CF编辑盒和切口酶
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RT融合酶的顺序转导和转染。图4C描绘
了采用微载体分区递送用于进行哺乳动物细胞的切口酶
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RT融合编辑的示例性工作流程。图4D描绘了采用微载体分区递送用于进行哺乳动物细胞的切口酶
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RT融合编辑的可选工作流程。
[0021]图5是示例性自动化多模块细胞处理仪器的实施方案的简化过程图，其包含用于在使用切口酶
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RT融合酶和在CF编辑盒的修复模板组分的3
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端具有gRNA稳定部分的CF编辑盒(StCFEC)的系统中递归细胞编辑(包括哺乳动物细胞编辑)的固体壁选择/单个化/生长/诱导/编辑/标准化装置。
[0022]图6包括两个图，所述图报告了显示具有3
’
gRNA稳定部分的CF编辑盒(StCFEC)增加GFP到BFP系统的编辑的结果。
[0023]图7是示出StCFEC的单拷贝数(SCN)递送相比于不含RNA稳定部分的CF编辑盒增加编辑的条形图。
[0024]图8是用于确定细胞生存力和编辑效率的实验设计的简化图。
[0025]图9是示出StCFEC mRNA的>90％转染效率的条形图。
[0026]图10是确认各种iPSC系中单拷贝和多拷贝CF编辑盒整合的条形图。
[0027]图11是示出在不同iPSC系中在不同CF编辑盒和StCFEC慢病毒转染稀释度下核酸酶mRNA(Cas9和MAD2007切口酶
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RT融合蛋白)转染后96小时时的细胞生存力的条形图。
[0028]图12显示了使用MAD2007切口酶
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RT融合蛋白在iPSC系中观察到的低得失位率(indel rate)。
[0029]图13是示出包含RNA稳定部分的慢病毒整合的(lenti
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integrated)CF编辑盒与不含稳定部分的CF编辑盒相比在五个iPSC系之间赋予稳健编辑的条形图。
[0030]图1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种CREATE融合编辑盒，所述CREATE融合编辑盒用于进行核酸引导的切口酶/逆转录酶融合编辑，从3
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至5
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包含：RNA修复模板，包含：RNA稳定部分；接头区；能够与切口的靶DNA结合的引物结合区；切口至编辑区；以及编辑后同源性区；gRNA，包含：引导序列；和支架区。2.根据权利要求1所述的CREATE融合编辑盒，其中所述RNA稳定部分是G四联体、RNA发夹、RNA假结或外切核糖核酸酶抗性RNA。3.根据权利要求2所述的CREATE融合编辑盒，其中所述RNA稳定部分是G四联体。4.根据权利要求3所述的CREATE融合编辑盒，其中所述RNA稳定部分是选自SEQ ID No:1；SEQ ID No:2；SEQ ID No:3；SEQ ID No:4；SEQ ID No:5；SEQ ID No:6；SEQ ID No:7；SEQ ID No:8；SEQ IDNo:9和SEQ ID No:10的G四联体。5.根据权利要求3所述的CREATE融合编辑盒，其中所述RNA稳定部分是选自SEQ ID No:11；SEQ ID No:12；SEQ ID No:13；SEQ ID No:14；SEQ ID No:15；SEQ ID No:16；SEQ ID No:17；SEQ ID No:18；SEQ ID No:19和SEQ ID No:20的G四联体。6.根据权利要求3所述的CREATE融合编辑盒，其中所述RNA稳定部分是选自SEQ ID No:21；SEQ ID No:22；SEQ ID No:23；SEQ ID No:24；SEQ ID No:25；SEQ ID No:26；SEQ ID No:27；SEQ ID No:28；SEQ ID No:29和SEQ ID No:30的G四联体。7.根据权利要求3所述的CREATE融合编辑盒，其中所述RNA稳定部分是选自SEQ ID No:31；SEQ ID No:32；SEQ ID No:33；SEQ ID No:34；SEQ ID No:35；SEQ ID No:36；SEQ ID No:37；SEQ ID No:38；SEQ ID No:39和SEQ ID No:40的G四联体。8.根据权利要求3所述的CREATE融合编辑盒，其中所述RNA稳定部分是选自SEQ ID No:...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿米尔，
申请(专利权)人：因思科瑞普特公司，
类型：发明
国别省市：