一种热稳定性提高的4-潮霉素B磷酸转移酶及其制备方法技术

本申请提供了一种工程化4

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性提高的4
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潮霉素B磷酸转移酶及其制备方法


[0001]本申请为生物
，具体涉及一种热稳定性提高的4
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潮霉素B磷酸转移酶，以及表达它的核苷酸和重组质粒。

技术介绍

[0002]嗜热微生物是一类最适生长温度大于45℃的微生物，在学术研究中对解析复杂蛋白复合物三维结构，追溯微生物进化过程，在工业生产中高温发酵分解纤维素，产氢气、甲烷、乙醇等能源中都起着关键作用。随着对嗜热微生物研究的不断深入，单纯地使用野生型或者筛选分离天然突变株已经不能满足嗜热微生物研究和生产的需求，针对嗜热微生物的基因改造成为进一步研究和应用的必经之路。而在进行基因改造中，筛选标签成为了最大的阻碍。由于嗜热微生物高温生长的固有属性和其他可能的嗜酸碱、嗜盐、嗜硫等特有属性，很多应用于常温微生物的筛选标签在嗜热微生物体内都无法发挥作用，这导致了缺乏筛选标签成为了很多嗜热微生物研究和应用所面临的问题(非专利文献1、2)。
[0003]现有的嗜热微生物筛选标签主要分为两种，营养缺陷型筛选标签和抗生素抗性筛选标签。在营养缺陷型筛选中，营养缺陷型菌株由于自然突变或人工诱变导致丧失合成某种营养物质的能力(氨基酸，核苷酸，维生素等)，需要依赖营养缺陷型筛选标签回补相应的合成途径才能在基本培养基(minimal medium)中正常生长(如非专利文献3中的乳清酸盐磷酸核糖基转移酶pyrE)。其中营养缺陷型筛选标签由于有1.需要繁琐的诱变筛选出特殊营养缺陷型菌株；2.需要对培养基进行缺陷营养物质的补充；3.对细胞内整体代谢通路有较大的影响；4.一个营养缺陷型标签只能针对同种属或亲缘关系相近的菌株进行应用，拓展性较差；等缺点，一定程度影响嗜热微生物的学术研究和工业应用。在抗生素筛选中，抗生素主要通过抑制核糖体或其他关键合成通路中的酶，使微生物无法正常生长，抗生素抗性筛选标签主要通过表达相应的抗性蛋白对抗生素进行修饰或外排，从而缓解或解除抗生素对微生物的抑制作用。抗生素抗性筛选标签有1.无需对菌株进行前期改造；2.适用于几乎任何培养基；3.筛选标签可拓展性强；等优点，是嗜热微生物筛选的理想标签。但由于应用于常温生物的抗生素抗性筛选标签通常无法在高温下进行工作，这也使得很多抗生素抗性筛选标签需要通过定向进化等方法提高稳定性后才可应用于嗜热微生物筛选。
[0004]潮霉素B(hygromycin B)属于氨基糖苷类(aminoglycoside)抗生素家族的成员之一，能抑制核糖体易位和翻译，对真核生物细胞和原核生物细胞都有较好的杀伤作用，已经广泛应用于如人类细胞HEK293T，小鼠细胞C57BL/6，秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans，各种酵母，真菌甚至是植物细胞(中国专利CN102703499A就利用Hph野生型对水稻进行基因改造)的筛选中。在这些筛选过程中，作为“解毒剂”的筛选标签，4
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潮霉素B磷酸转移酶(4
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hygromycin B phosphotransferase,缩写Hph)能催化ATP上的γ
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磷酸基团转移到潮霉素B的2
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脱氧链霉氨的第4位羟基上，使细胞获得潮霉素B的抗性。潮霉素B和4
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潮霉素B磷酸转移酶的筛选组合由于其适用范围广(对真核生物和原核生物均适用)，假阳性少，与其他抗生素筛选兼容性好，是一种在嗜热微生物中具有广阔应用前景的筛选标签。
[0005]虽然Hph已经广泛应用作各种常温生长的生物筛选中，但是由于Hph本身稳定性问题，无法在嗜热微生物中发挥作用。前人针对Hph进行了一些稳定性改造的尝试。在1998年，Cannio等人使用定向进化的方法得到了一个Hph双点突变，本专利简称为Hph2(S52T,W238C)(非专利文献4)。在后续的表征中，Cannio等人发现该突变体能支持嗜热硫化叶菌Sulfolobus solfataricus在最高82℃获得潮霉素B抗性，且该突变体在60℃，30min热处理后仍然保留30％的初始酶活(非专利文献5)。但后续Jonuscheit等人(非专利文献6)和Nakamura等人(非专利文献7)均无法重复出Cannio等人结果中Hph2的高稳定性。在2005年，Nakamura等人对Hph重新进行了定向进化，获得了一个Hph的五点突变体Hph5(D20G,A118V,S225P,Q226L,T246A)，该突变能支持嗜热栖热菌Thermus thermophilus在最高67℃获得潮霉素B抗性(非专利文献7)。在后续的表征中，Nakamura等人发现Hph5在55℃，30min处理后人能保留50％的初始酶活(非专利文献8)。总结而言，这些前人研究对于Hph稳定化改造的尝试取得了一定的成功，但在稳定性方面上仍然存在提升空间，我们将进一步提升Hph的稳定性，同时在提升稳定性的同时尽可能保留Hph的酶活，为将Hph开发成为新型嗜热微生物筛选标签奠定基础。

技术实现思路

[0006]为解决上述问题，本申请提供了：
[0007]1.一种工程化4
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潮霉素B磷酸转移酶(Hph)，其基于参比4
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潮霉素B磷酸转移酶(参比Hph)经历下述氨基酸替换而得到：
[0008](1)将参比Hph疏水内核中的氨基酸替换为疏水氨基酸；和/或
[0009](2)将参比Hph氨基酸替换为能形成氢键或盐桥的氨基酸和/或
[0010](3)将参比Hph表面疏水氨基酸替换为亲水氨基酸；和/或
[0011](4)将参比Hph中较为拥挤局部中氨基酸替换为侧更小或者没有侧链的氨基酸。
[0012]2.如项1所述的工程化4
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潮霉素B磷酸转移酶(Hph)，其中，该工程化Hph相对于参比Hph具有更高的热稳定性，其中参比Hph为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其中所述工程化的4
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潮霉素B磷酸转移酶CysG
A
荧光值分别相比参比Hph至少增加50％。
[0013]3.如项2所述的工程化4
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潮霉素B磷酸转移酶(Hph)，其中，所述氨基酸替换为基于SEQ ID NO.1进行以下中的任意一种或两种以上氨基酸替换：T164S、E180L、E219G、S225P、Q226L、W238R、T246S、S277A、D280K、W317C和K340N。
[0014]4.如项2所述的工程化4
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潮霉素B磷酸转移酶(Hph)，其中，所述氨基酸替换为基于SEQ ID NO.2进行以下中的任意一种或两种以上氨基酸替换：R44E、H158N和C293L。
[0015]5.如项3所述的工程化4
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潮霉素B磷酸转移酶(Hph)，其中，所得到的工程化Hph的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0016]6.如项4所述的工程化4
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种4
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潮霉素B磷酸转移酶(Hph)，其基于参比4
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潮霉素B磷酸转移酶(参比Hph)经历下述氨基酸替换而得到：(1)将参比Hph疏水内核中的氨基酸替换为疏水氨基酸；和/或(2)将参比Hph氨基酸替换为能形成氢键或盐桥的氨基酸和/或(3)将参比Hph表面疏水氨基酸替换为亲水氨基酸；和/或(4)将参比Hph中较为拥挤局部中氨基酸替换为侧链更小或者没有侧链的氨基酸。2.如权利要求1所述的4
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潮霉素B磷酸转移酶(Hph)，其中，该工程化Hph相对于参比Hph具有更高的热稳定性，其中参比Hph为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其中所述工程化的4
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潮霉素B磷酸转移酶利用CysG
A
探针测得的荧光值分别相比参比Hph至少增加50％。3.如权利要求2所述的4
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潮霉素B磷酸转移酶(Hph)，其中，所述氨基酸替换为基于SEQ ID NO.1进行以下中的任意一种或两种以上氨基酸替换：T164S、E180L、E219G、S225P、Q226L、W238R、T246S、S277A、D280K、W317C和K340N。4.如权利要求2所述的4
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潮霉素B磷酸转移酶(Hph)，其中，所述氨基酸替换为基于SEQ ID NO.2进行以下中的任意一种或两种以上氨基酸替换：R44E、H158N和C293L。5.如权利要求3所述的4
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潮霉素B磷酸转移酶(Hph)，其中，所得到的工程化Hph的氨基酸序列如SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：全舒，孟子钧，刘春兰，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：