本发明专利技术涉及一种自组装多肽RAKA 16的固相合成方法。该方法包括：制备X1全保护片段和X2全保护片段；将X1全保护片段和X2全保护片段依次间隔连接Rink Resin上；脱保护试剂脱除Fmoc保护基，乙酸酐和吡啶混合溶液进行N端的乙酰化，经裂解，沉降得到的固体粗肽，将粗品经HPLC提纯，冻干后得精肽的冻干粉末。本发明专利技术选用片段X1和X2全保护肽合成RAKA 16，简化了操作步骤，缩短了反应周期，且可以有效控制消旋杂质和缺失杂质的产生，降低了纯化的难度，有着较好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于有机合成领域，尤其涉及一种自组装多肽raka 16的固相合成方法。
技术介绍
1、 自组装多肽可以利用氢键、疏水作用、π-π堆积作用等非共价键力自组装成形态与结构特异的组装体，且由于多肽具有良好的生物相容性和可控的降解性能，因此被广泛应用于3d打印、细胞储存，组织工程支架等研究领域。其中raka 16已被开发为止血剂和水凝胶敷料等医疗产品。
2、 raka 16的肽序为：
3、ac- arg-ala-asp-ala-glu-ala-lys-ala-arg-ala-asp-ala-glu-ala-lys-ala-nh
4、自组装多肽raka 16的合成，一般采用逐步偶联的方式。将16位至1位的保护氨基酸通过脱保护和偶联的方式依次连接在氨基酸树脂上。由于受多肽二级结构的影响，在连接至第9位arg和第1位arg时，反应位点的空间位阻变大，偶联反应困难，容易产生较多的缺失杂质，影响合成收率并且提高了纯化难度。
5、 综上，现有合成raka 16的方法，合成周期较长，且容易引入一些难以去除的缺失肽和消旋肽，并且影响收率。
技术实现思路
1、本专利技术提出一种自组装多肽raka 16的合成方法，其目的在于解决现有合成raka16的方法，合成周期长，且容易引入一些难以去除的缺失肽和消旋肽，并且影响收率的问题。
2、技术方案：
3、本专利技术提出一种自组装多肽raka 16的固相合成方法，包括以下步骤：
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p>4、s1、制备x1全保护片段，x1全保护片段为fmoc-arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-oh；5、s2、制备x2全保护片段，x2全保护片段为fmoc-glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala-oh；
6、s3、先用脱保护试剂脱除rink resin的fmoc保护基，再用缩合试剂将x1全保护片段和x2全保护片段依次间隔偶联在rink resin上，得x1-x2-x1-x2-rink resin，即fmoc-arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala-arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala- glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala -rink resin；
7、s4、x1-x2-x1-x2-rink resin用脱保护试剂脱除fmoc保护基，再用乙酸酐和吡啶混合溶液进行n端的乙酰化，得到ac- arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala-arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala -rink resin；
8、s5、裂解ac- arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala-arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala -rink resin，裂解反应液经过滤，沉降得到的固体粗肽，固体粗肽通过乙醚重复洗涤离心2~5次，得到洗涤后的粗肽，将粗肽干燥至不再减重，得到ac- arg-ala-asp-ala-glu-ala-lys-ala-arg-ala-asp-ala-glu-ala-lys-ala-nh2粗品；
9、s6、将粗品经hplc提纯，冻干后得ac- arg-ala-asp-ala-glu-ala-lys-ala-arg-ala-asp-ala-glu-ala-lys-ala-nh2精肽的冻干粉末。
10、 进一步的，所述rink resin的替代度为0.2~0.8mmol/g。
11、 进一步的，步骤s4中脱除fmoc保护基的x1-x2-x1-x2-rink resin与乙酸酐和吡啶的摩尔比为1：(5~20)：(5~20)。
12、 进一步的，步骤s5中所述粗品经hplc提纯之前，需用n-甲基吡咯烷酮或dmf溶解粗品，至粗品的浓度为0.5 ~1mmol/l。
13、优选的，所述x1全保护片段的制备步骤如下：
14、1a、制备fmoc- ala-ctc resin：向溶胀后的2-ctc rsein中加入fmoc-ala-oh和有机碱，得到fmoc-ala- ctc resin；
15、1b、fmoc-ala- ctc resin采用逐步偶联的方式，先用脱保护试剂脱除fmoc保护基，再用缩合试剂依次偶联氨基酸原料fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ala-oh和fmoc-arg(pbf)-oh，得到fmoc-arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-ctc resin；
16、1c、采用全保护裂解的方式裂解fmoc-arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-ctc resin，得到x1全保护片段，即fmoc-arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-oh；
17、所述x2全保护片段的制备步骤如下：
18、2a、向溶胀后的2-ctc rsein中加入fmoc-ala-oh和有机碱，得到fmoc-ala- ctcresin；
19、2b、fmoc-ala- ctc resin采用逐步偶联的方式，先用脱保护试剂脱除fmoc保护基，再用缩合试剂依次偶联氨基酸原料fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ala-oh和fmoc-glu(otbu)-oh，得到fmoc- glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala -ctc resin；
20、2c、采用全保护裂解的方式裂解fmoc-glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala-ctc resin，得x2全保护片段，即fmoc- glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala-oh。
21、 优选的，步骤1a和2a中所述的有机碱为dipea，且有机碱与2-ctc rsein、fmoc-ala-oh的摩尔比为（2~10）：1：（1~5）。
22、优选的，所述全保护裂解试剂为tfe的二氯甲烷溶液，tfe与二氯甲烷体积比为（10~25）：（75~90）；全保护裂解试剂用量为1g肽树脂/10ml全保护裂解试剂。
23、优选的，所述缩合试剂为等摩尔比的dic和hobt的混合液，或者等摩尔比的pybop和diea和hobt的混合液；或者等摩尔比的hbtu和diea和hobt的混合液；
24、在步骤s3中缩合试剂、rink resin、x1全保护片段或者x2全保护片段的摩尔比为（4.8~12）：1：（2~5）；
25、在步骤1b和2b中缩合试剂、fmoc-ala- ctc resin、氨基酸原料的摩尔比为（4.8~12）：1：（2本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种自组装多肽RAKA 16的固相合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的RAKA 16的固相合成方法，其特征在于：所述Rink Resin的替代度为0.2~0.8mmol/g。
3.根据权利要求1所述的RAKA 16的固相合成方法，其特征在于：步骤S4中脱除Fmoc保护基的X1-X2-X1-X2-Rink Resin与乙酸酐和吡啶的摩尔比为1：(5~20)：(5~20)。
4.根据权利要求1所述的RAKA 16的固相合成方法，其特征在于：步骤S5中所述粗品经HPLC提纯之前，需用N-甲基吡咯烷酮或DMF溶解粗品，至粗品的浓度为0.5 ~1mmol/L。
5.根据权利要求1所述的RAKA 16的固相合成方法，其特征在于：
6.根据权利要求5所述的RAKA 16的固相合成方法，其特征在于：步骤1a和2a中所述的有机碱为DIPEA，且有机碱与2-CTC Rsein、Fmoc-Ala-OH的摩尔比为（2~10）：1：（1~5）。
7.根据权利要求5所述的RAKA 16的固相合成方法，其特征在于：所述全保护裂解试剂为TFE的二氯甲烷溶液，TFE与二氯甲烷体积比为（10~25）：（75~90）；全保护裂解试剂用量为1g肽树脂/10ml全保护裂解试剂。
8.根据权利要求1或5所述的RAKA 16的固相合成方法，其特征在于：所述缩合试剂为等摩尔比的DIC和HOBt的混合液，或者等摩尔比的PyBOP和DIEA和HOBt的混合液；或者等摩尔比的HBTU和DIEA和HOBt的混合液；
9.根据权利要求1或5所述的RAKA 16的固相合成方法，其特征在于：所述脱保护试剂为哌啶和DMF的混合溶液，二者体积比为哌啶：DMF=1：4；脱保护试剂的用量为1g肽树脂/（10-20）ml脱保护试剂。
10.根据权利要求1所述的RAKA 16的固相合成方法，其特征在于：所述裂解的裂解液为三氟乙酸溶液，其中三氟乙酸的体积占比为85%~95%；裂解时间为2~4h，裂解温度为25~45℃；裂解液用量为1g肽树脂/10ml裂解液。
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【技术特征摘要】
1.一种自组装多肽raka 16的固相合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的raka 16的固相合成方法，其特征在于：所述rink resin的替代度为0.2~0.8mmol/g。
3.根据权利要求1所述的raka 16的固相合成方法，其特征在于：步骤s4中脱除fmoc保护基的x1-x2-x1-x2-rink resin与乙酸酐和吡啶的摩尔比为1：(5~20)：(5~20)。
4.根据权利要求1所述的raka 16的固相合成方法，其特征在于：步骤s5中所述粗品经hplc提纯之前，需用n-甲基吡咯烷酮或dmf溶解粗品，至粗品的浓度为0.5 ~1mmol/l。
5.根据权利要求1所述的raka 16的固相合成方法，其特征在于：
6.根据权利要求5所述的raka 16的固相合成方法，其特征在于：步骤1a和2a中所述的有机碱为dipea，且有机碱与2-ctc rsein、fmoc-ala-oh的摩尔比为（2~10）：1：（1~5）。
【专利技术属性】
技术研发人员：张胜有，董肇楠，郑春旭，
申请(专利权)人：苏州赛普生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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