本发明专利技术提供增强肝细胞增殖能力的方法或培养肝细胞的方法及其应用。所述方法包括：将肝细胞中Ubr5基因编码的蛋白表达下调或活性抑制，所述肝细胞是非癌肝细胞。利用该方法可有效诱导并增强肝细胞的增殖能力，肝细胞的扩增数量和传代次数显著提高，并且获得的肝细胞仍保持肝实质细胞的特征；利用该方法可实现体外人肝原代细胞高效、快速、长期扩增，具有广阔的应用前景。的应用前景。的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
增强肝细胞增殖能力或培养肝细胞的方法及其应用
[0001]本专利技术涉及细胞培养领域，特别涉及一种增强肝细胞增殖能力的方法或培养肝细胞的方法及其应用。
技术介绍
[0002]人的肝脏拥有强大的再生能力，例如肝损伤导致肝质量的损失时，肝脏细胞将代偿性增生以恢复原始肝/体重比。动物实验表明，部分肝脏切除肝脏重量的70％后，剩余肝脏可以短时间内再生以达到其原来的重量(GaubandIversen,1984)。但是，一旦人或者动物的原代肝细胞在体外进行培养，就会迅速失去肝脏的代谢能力(Marchetal.,2015)，并且原代肝细胞的扩增能力也十分有限。长久以来，对于肝脏失能(肝炎、酒精、胆汁积淤性肝硬化等)患者，整肝移植成为唯一治疗手段。然而肝脏供体来源严重不足，获得大量的具有功能的肝实质细胞是再生医学亟待解决的难题。
[0003]亟需开发高效、快速、长期的体外人肝原代细胞扩增方法。
技术实现思路
[0004]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本专利技术提供一种增强肝细胞增殖能力的方法或培养肝细胞的方法及其应用，利用该方法可有效诱导并增强肝细胞的增殖能力，肝细胞的扩增数量和传代次数显著提高，并且获得的肝细胞仍保持肝实质细胞的特征，利用该方法可实现体外人肝原代细胞高效、快速、长期扩增，具有广阔的应用前景。
[0005]需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列工作而完成的：
[0006]专利技术人创造性地发现，在非癌肝细胞中，抑制其Ubr5蛋白的表达和活性，进一步通过基因工程手段改造得到的肝细胞(比如人原代肝细胞)，其增殖能力显著增强。具体地，细胞扩增数量和传代次数显著提高，可实现高效、快速、长期的体外肝细胞(比如人原代肝细胞)扩增。
[0007]进一步的试验结果表明：经本专利技术的方法获得的肝细胞，其可在体内或体外传代至少10代，且每次传代扩增的细胞数量可提高至10倍左右。
[0008]因此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种增强肝细胞增殖能力的方法或培养肝细胞的方法。所述方法包括：将肝细胞中Ubr5基因编码的蛋白表达下调或活性抑制，所述肝细胞是非癌肝细胞。利用该方法可有效诱导肝细胞的增殖能力，肝细胞的扩增数量和传代次数显著提高，并且所得肝细胞仍保持肝实质细胞的特征。由此，实现了体外人肝原代细胞高效、快速、长期扩增。
[0009]示例性地，本专利技术Ubr5蛋白表达下调或活性抑制的方法，包括不限于：基因沉默或敲除、使用本领域已知的抑制Ubr5蛋白表达或活性的其他方法或试剂处理肝细胞(例如原代肝细胞)。由此，实现有效诱导并增强肝细胞增殖能力、培养收获肝细胞的目的。
[0010]根据本专利技术的实施例，将所述肝细胞中的Ubr5基因沉默或敲除。
[0011]根据本专利技术的实施例，将具有沉默或敲除肝细胞Ubr5基因活性的作用的核酸或包含其的核酸构建物引入所述肝细胞，所述核酸靶向Ubr5基因。
[0012]示例性地，本专利技术将所述核酸引入细胞的方法，包括不限于：磷酸钙沉淀法、脂质转染法、粒子轰击法、微注射法、电穿孔法，或使用DNA和RNA载体的方法，或使用胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠，或基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。
[0013]根据本专利技术的实施例，所述核酸包含：shRNA、siRNA和sgRNA中的至少之一。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述shRNA具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有沉默Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列。
[0015]根据本专利技术的实施例，所述siRNA具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有沉默Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列。
[0016]根据本专利技术的实施例，所述sgRNA具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有敲除Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列。
[0017]根据本专利技术的实施例，所述shRNA具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0018]根据本专利技术的实施例，所述siRNA具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
[0019]根据本专利技术的实施例，所述sgRNA具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
[0020]根据本专利技术的实施例，所述核酸构建物是病毒载体。
[0021]根据本专利技术的实施例，所述病毒载体是非致病性病毒载体。
[0022]根据本专利技术的实施例，所述非致病性病毒载体任选自逆转录病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒I载体、慢性毒载体、腺病毒载体和腺病毒相关病毒载体之一。
[0023]根据本专利技术的实施例，所述非致病性病毒载体是慢病毒载体。
[0024]根据本专利技术的实施例，所述肝细胞扩增数量和/或传代次数增加。
[0025]根据本专利技术的实施例，所述肝细胞是哺乳动物肝细胞。
[0026]根据本专利技术的实施例，所述肝细胞是非成熟肝细胞。
[0027]根据本专利技术的实施例，所述肝细胞是原代肝细胞或其衍生细胞。
[0028]在本专利技术的第二方面，本专利技术提供了一种分离的核酸。所述核酸靶向Ubr5基因，具有沉默或敲除肝细胞Ubr5基因活性的作用，所述肝细胞是非癌肝细胞。
[0029]根据本专利技术的实施例，所述核酸包含：shRNA、siRNA和sgRNA中的至少之一。
[0030]根据本专利技术的实施例，所述shRNA具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有沉默Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列。
[0031]根据本专利技术的实施例，所述siRNA具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有沉默Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列。
[0032]根据本专利技术的实施例，所述sgRNA具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有敲除Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列。
[0033]包含该核酸的核酸构建物可对Ubr5基因进行沉默或敲除，通过该基因工程手段改造得到的肝细胞，其Ubr5基因编码的蛋白表达下调或活性抑制。由此，细胞增殖能力显著增强，细胞扩增数量和传代次数显著提升，实现高效、快速、长期的体外人肝原代细胞扩增。
[0034]根据本专利技术的实施例，所述shRNA具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0035]根据本专利技术的实施例，所述siRNA具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
[0036]根据本专利技术的实施例，所述sgRNA具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
[0037]根据本专利技术的实施例，所述肝细胞是哺乳动物肝细胞。
[0038]根据本专利技术的实施例，所述肝细胞是非成熟肝细胞。
[0039]根据本专利技术的实施例，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种增强肝细胞增殖能力的方法或培养肝细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：将肝细胞中Ubr5基因编码的蛋白表达下调或活性抑制，所述肝细胞是非癌肝细胞；任选地，将所述肝细胞中的Ubr5基因沉默或敲除；任选地，将具有沉默或敲除肝细胞Ubr5基因活性的作用的核酸或包含其的核酸构建物引入所述肝细胞，所述核酸靶向Ubr5基因；任选地，所述核酸包含：shRNA、siRNA和sgRNA中的至少之一；任选地，所述shRNA具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有沉默Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列；任选地，所述siRNA具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有沉默Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列；任选地，所述sgRNA具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有敲除Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列；任选地，所述shRNA具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；任选地，所述siRNA具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；任选地，所述sgRNA具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；任选地，所述核酸构建物是病毒载体；任选地，所述病毒载体是非致病性病毒载体；任选地，所述非致病性病毒载体任选自逆转录病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒I载体、慢性毒载体、腺病毒载体和腺病毒相关病毒载体之一；任选地，所述非致病性病毒载体是慢病毒载体；任选地，所述肝细胞扩增数量和/或传代次数增加；任选地，所述肝细胞是哺乳动物肝细胞；任选地，所述肝细胞是非成熟肝细胞；任选地，所述肝细胞是原代肝细胞或其衍生细胞。2.一种分离的核酸，所述核酸靶向Ubr5基因，具有沉默或敲除肝细胞Ubr5基因活性的作用，所述肝细胞是非癌肝细胞；任选地，所述核酸包含：shRNA、siRNA和sgRNA中的至少之一；任选地，所述shRNA具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有沉默Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列；任选地，所述siRNA具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有沉默Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列；任选地，所述sgRNA具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有敲除Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列；任选地，所述shRNA具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；任选地，所述siRNA具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏劲松，林鑫华，
申请(专利权)人：粤港澳大湾区精准医学研究院广州，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。