制备重组软骨祖细胞的方法及获得的重组软骨祖细胞与应用技术

本发明专利技术公开了遗传工程领域中制备重组软骨祖细胞的方法及获得的重组软骨祖细胞与应用。本发明专利技术所要解决的技术问题是如何提供一种能够治疗骨关节炎的细胞制品。为了解决该技术问题，本发明专利技术提供了制备重组软骨祖细胞的方法，所述方法包括如下步骤：1）分离软骨祖细胞：酶解消化离体的关节透明软骨得到酶解物，利用软骨祖细胞的迁移特性培养所述酶解物得到软骨祖细胞；2）向所述软骨祖细胞中导入TNFAIP3蛋白质的编码基因，得到所述重组软骨祖细胞。本发明专利技术可用于治疗和/或预防和/或缓解和/或改善骨关节炎。善骨关节炎。

【技术实现步骤摘要】
制备重组软骨祖细胞的方法及获得的重组软骨祖细胞与应用


[0001]本专利技术涉及遗传工程领域中制备重组软骨祖细胞的方法及获得的重组软骨祖细胞与应用。

技术介绍

[0002]骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨破坏和持续性疼痛为特征的慢性退行性疾病，伴有结构和功能损伤，其发病率高，病程长，且患病率呈上升趋势。目前，治疗骨关节炎的药物主要以缓解症状为主，到中晚期的患者需进行关节置换手术才能缓解疼痛。以往研究表明，骨关节炎的发生和发展与创伤、代谢、炎症等多种因素有关，这些因素相互作用，导致大多数治疗方法的疗效较差。因此，迫切需要研发新的治疗策略来延缓骨关节炎的进展。
[0003]近年来，干细胞在治疗骨关节炎中得到了研究。但因干细胞具有组织异质性及其作用机制尚不明确，其治疗骨关节炎的疗效还有待提高。软骨祖细胞被认为是骨骼中具有软骨生成潜能和高复制能力的组织特异性干细胞，近年来研究表明，软骨祖细胞在软骨再生修复应用中有很大的优势，有助于骨的发育、稳态、衰老和再生。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够治疗骨关节炎的细胞制品。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种制备重组软骨祖细胞的方法，所述方法包括如下步骤：1）分离软骨祖细胞：酶解消化离体的关节透明软骨得到酶解物，利用软骨祖细胞的迁移特性培养所述酶解物得到软骨祖细胞；2）向所述软骨祖细胞中导入肿瘤坏死因子α诱导蛋白3的编码基因，得到所述重组软骨祖细胞。
[0006]进一步地，上述方法中所述重组软骨祖细胞表达TNFAIP3蛋白质。
[0007]所述肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNF alpha induced protein 3，TNFAIP3)为下述任一种蛋白质，A1）氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；A2）将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1）所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；A3）在A1）或A2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
[0008]所述TNFAIP3蛋白质的编码基因是编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子。
[0009]进一步地，上述方法中所述方法不包括软骨细胞的去分化。
[0010]进一步地，上述方法中利用软骨祖细胞的迁移特性培养所述酶解物包括利用培养贴壁细胞的培养基进行培养的步骤。
[0011]上文中所述培养贴壁细胞的培养基可含有体积百分数为10%的FBS（胎牛血清）。
[0012]上文中所述培养贴壁细胞的培养基可为向α
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MEM培养基中添加FBS、青霉素和链霉素得到的液体培养基（完全培养基），所述培养贴壁细胞的培养基中FBS的体积百分数为10%，青霉素的含量可为100单位/ml，链霉素的含量可为100ng/ml。
[0013]进一步地，上述方法中所述关节透明软骨来源于人，具体来源于人的膝关节。
[0014]进一步地，上述方法中所述酶解消化用胶原酶进行。
[0015]上文中所述胶原酶可为Ⅱ型胶原酶。
[0016]上文中所述酶解消化可在Ⅱ型胶原酶的含量可为125 CDU/mL的酶解反应体系中，37℃消化2小时。
[0017]进一步地，上述方法中所述软骨祖细胞具有通过分泌作用抑制破骨细胞的形成和/或骨吸收的能力。
[0018]本专利技术还提供了一种重组软骨祖细胞，所述重组软骨祖细胞由前述方法制备。该重组软骨祖细胞表达氨基酸是SEQ ID No.1的蛋白质。
[0019]本专利技术还提供了一种治疗和/或预防和/或缓解和/或改善骨关节炎的药物，所述药物由药用辅料和前述的重组软骨祖细胞组成。
[0020]进一步地，上述药物的剂型为注射剂。
[0021]本专利技术通过实验证明，TNFAIP3基因修饰人软骨祖细胞可以有效减轻骨关节炎的病理损害，同时可抑制软骨下成骨细胞发生坏死性凋亡，对创伤性骨关节炎具有保护作用。
附图说明
[0022]图1为TNFAIP3基因修饰的人软骨祖细胞的荧光图及TNFAIP3的Western blotting结果。A图中上图为经TNFAIP3过表达载体LV5基因修饰的软骨祖细胞的荧光图，A图中下图为经TNFAIP3基因修饰的软骨祖细胞的荧光图；B图为经过载体LV5及TNFAIP3基因修饰过的软骨祖细胞的WB结果，左边第一泳道为载体LV5，第二泳道为TNFAP3过表达，第一行为TNFAP3抗体的WB结果，第二行为GAPDH抗体的WB结果。
[0023]图2为本专利技术实施例1提供的P0
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P5代软骨祖细胞生长曲线图及P1
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P5代群体倍增时间图。
[0024]图3为本专利技术实施例1提供的软骨祖细胞形态图。
[0025]图4为本专利技术实施例1提供的软骨祖细胞流式表型图。
[0026]图5为本专利技术实施例1提供的软骨祖细胞三系分化能力鉴定图。从左至右依次为结晶紫染色结果、ALP染色结果、甲苯胺蓝（Toluidine Blue）染色结果和油红O（Oil Red O）染色结果。
[0027]图6为本专利技术实施例1提供的软骨祖细胞核型分析图。
[0028]图7为本专利技术实施例1提供的软骨祖细胞体内成瘤马松染色图。
[0029]图8为TNFAIP3基因修饰的人软骨祖细胞改善创伤性骨关节炎动物模型的骨影像学结构。从左往右的第一列的上图为对照组大鼠关节的Micro
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CT图，第一列的中图为对照组大鼠关节对应的软骨下骨图像，第一列的下图为对照组大鼠关节胫骨平台的三维图像；
第二列的上图为OA组大鼠关节的Micro
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CT图，第二列的中图为OA组大鼠关节对应的软骨下骨图像，第二列的下图为OA组大鼠关节胫骨平台的三维图像；第三列的上图为关节腔注射稳转空载质粒的人软骨祖细胞组的大鼠关节的Micro
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CT图，第三列的中图为关节腔注射稳转空载质粒的人软骨祖细胞组的大鼠关节对应的软骨下骨图像，第三列的下图为关节腔注射稳转空载质粒的人软骨祖细胞细胞组的大鼠关节胫骨平台的三维图像；第四列的上图为关节腔注射TNFAIP3基因修饰的软骨祖细胞组的大鼠关节的Micro
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CT图，第四列的中图为关节腔注射TNFAIP3基因修饰的软骨祖细胞组的大鼠关节对应的软骨下骨图像，第四列的下图为关节腔注射TNFAIP3基因修饰的软骨祖细胞组的大鼠关节胫骨平台的三维图像。
[0030]图9为TNFAIP3基因修饰的人软骨祖细胞改善创伤性骨关节炎的关节组织学形态。从左往右的第一列的第一图为对照组大鼠关节部位的苏木精
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伊红染色，第一列的第二图为对照组大鼠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.制备重组软骨祖细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1）分离软骨祖细胞：酶解消化离体的关节透明软骨得到酶解物，利用软骨祖细胞的迁移特性培养所述酶解物得到软骨祖细胞；2）向所述软骨祖细胞中导入肿瘤坏死因子α诱导蛋白3的编码基因，得到所述重组软骨祖细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组软骨祖细胞表达所述肿瘤坏死因子α诱导蛋白3。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法不包括软骨细胞的去分化。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，利用软骨祖细胞的迁移特性培养所述酶解物包括利用培养贴壁细胞的培养基进行培养的步骤。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱恒，李晓彤，李志凌，李佩霖，王飞燕，张晓宇，尹博丰，郝瑞聪，汤杰，张文静，赵世荣，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：