一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，涉及细胞生物学技术领域，该方法包括EGFR A289V突变的获取、载体质粒双酶切、基因特异性扩增、同源重组酶连、钙转法包装慢病毒和目的细胞慢病毒感染与筛选六个步骤。能够得到能稳定表达EGFRA289V突变的胶质瘤细胞系，保证无菌环境，避免了标本转移带来的污染问题，所采用的细胞系较为稳定，能够减少实验的干扰因素，实验的操作简便，花费低。花费低。花费低。

【技术实现步骤摘要】
一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法


[0001]本专利技术涉及细胞生物学
，更具体地说，它涉及一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法。

技术介绍

[0002]胶质母细胞瘤(Glioblastoma，GBM)是恶性程度最高的胶质瘤，由于GBM侵袭生长迅速，手术难以完全切除，且易复发，其治疗一直是医学上的难点。近些年来，关于GBM驱动基因的多项研究表明，GBM与表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)密切相关。大多数GBM存在EGFR基因状态的改变，其中EGFR基因突变以胞外结构域(Extracellular Domain,ECD)突变最为常见。EGFR VIII缺失突变为胞外区突变的主要突变形式，而胞外区错义突变中以EGFR A289V突变频率最高。后续研究发现EGFR A289V为主的EGFR ECD错义突变同样可以成为引起恶性胶质瘤发生、发展的驱动因素。所以近些年来，EGFR胞外区突变成为GBM研究的新方向。
[0003]在各项针对GBM胞外结构域突变的基础研究中总免不了使用相关的胶质瘤细胞系。但是目前针对GBM中EGFR胞外区错义突变的基础研究极为稀少，且使用的胶质瘤细胞系大多为人源肿瘤组织提取培养的原代细胞。主要方法是将手术中获取的新鲜胶质瘤标本，用含抗生素的无血清培养基冲洗过后，将其处理成0.5
‑
1.0mm3的小块组织种植于培养瓶进行培养，或者使用0.25％胰蛋白酶消化过滤成细胞悬液再进行培养传代。之后将所得的原代细胞进行NGS测序，选出所需要的原代细胞进行后续的研究。其优势为：直接从患者的肿瘤组织中提取，更加直观地从现实层面反应出所研究的EGFR突变对临床诊疗造成的影响。但缺陷也很明显：(1)标本材料需要尽可能的新鲜，还要无菌操作，但是手术标本获取再转运至实验室的过程中容易造成污染。(2)由于放化疗会抑制胶质瘤的生长，降低原代培养成功率，因此最好是选取未经过治疗的首诊患者，但这类组织获取较为困难。(3)这类原代细胞还需要经过NGS检测以挑选产生符合实验要求的突变才可进行使用。多项限制条件使得此方法需要大量的临床标本数据，同时反复的测序所花费的时间及成本较为高昂。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，能够得到能稳定表达EGFR A289V突变的胶质瘤细胞系，保证无菌环境，避免了标本转移带来的污染问题，所采用的细胞系较为稳定，能够减少实验的干扰因素，实验的操作简便，花费低。
[0005]本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，所述方法包括以下六个步骤：
[0006]S1.EGFR A289V突变的获取；
[0007]S2.载体质粒双酶切；
[0008]S3.基因特异性扩增；
[0009]S4.同源重组酶连；
[0010]S5.钙转法包装慢病毒；
[0011]S6.目的细胞慢病毒感染与筛选。
[0012]本专利技术进一步设置为：所述S1中EGFR A289V突变的获取具体操作如下：从NCBI官网获取EGFR基因全长信息，以EGFR野生型为模板，其胞外结构域第289个氨基酸突变为EGFR A289V突变。
[0013]本专利技术进一步设置为：所述S2中载体质粒双酶切具体操作如下：选用骨架为CD510B
‑1‑
pCDH
‑
CMV
‑
EF1
‑
Puro的慢病毒质粒pCDH
‑
VHL
‑
HA作为载体质粒，用限制性核酸内切酶XbaI、NotI对其进行双酶切，制备线性化载体；其反应体系在冰上配制，反应体系中包含5uL Cutsmart、1uL XbaI、1uL NotI、2.5ug载体质粒，用双蒸水补齐至50ul,在37℃下过夜酶切,酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离并进行胶回收得到线性化载体。
[0014]本专利技术进一步设置为：所述S3中基因特异性扩增具体操作如下：
[0015]①
设计EGFR A289V突变质粒的特异性扩增引物，引物序列为：
[0016]EGFR
‑
F(5'
‑
3'):ATAGAAGATTCTAGAATGCGACCCTCCGGGAC；
[0017]EGFR
‑
R(5'
‑
3'):ATCCTTCGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAAT CTGCTCCAATAAATTC；
[0018]②
PCR反应体系：其中包含25uL Pfu mix(2
×
)、5uL正向引物、5uL反向引物、50ng EGFR A289V突变质粒，再用双蒸水补齐至50ul；
[0019]③
PCR反应程序：调试PCR仪，使其温度在94℃维持5min，实现预变性；随后继续在94℃下维持5s实现变性；再退火至68℃下维持2.5min；在72℃下延伸5min；在72℃下再延伸5min；循环30次；
[0020]④
反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物并胶回收得到纯化的PCR扩增产物。
[0021]本专利技术进一步设置为：所述S4中同源重组酶连具体操作如下：
[0022]①
同源重组反应体系：所述反应体系中包含150ng线性化载体、200ng纯化的PCR扩增产物、4uL 5x Ligation
‑
Free cloning Master Mix，再用双蒸水补齐至20ul；
[0023]②
将反应体系放置于冰上孵育30min，取实验室保存的STBL3感受态细胞于冰上融化；将反应体系与感受态细胞混合后在冰上放置40min，在42℃热激90s,随即继续冰上孵育10min，加入500ul无抗性的液体LB培养基，37℃、220rpm摇菌活化2小时，活化后的菌液2000rpm离心5min，弃去大部分上清液，留约50ul上清液混合吹匀，使用涂布棒将菌液均匀铺满含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板培养皿中，涂布棒浸于75％酒精中，使用前于酒精灯上灼烧晾凉后再涂布平板，平板倒置于37℃培养箱中，过夜培养后观察单克隆菌落生长状况，用灭菌的10ul枪头挑取平板中的单克隆菌落，接种在含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，培养基的总体积为5ml，其中氨苄青霉素：LB培养基＝1:1000，摇床设置37℃、220rpm，过夜摇菌；
[0024]③
菌落PCR验证上述单克隆菌落后，将菌落PCR结果经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果为阳性的菌液移至200ml含氨苄青霉素的液体LB培养基中再次摇菌12h，利用无内毒素大抽质粒试剂盒抽提质粒，得到重组慢病本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，其特征是：所述方法包括以下六个步骤：S1.EGFRA289V突变的获取；S2.载体质粒双酶切；S3.基因特异性扩增；S4.同源重组酶连；S5.钙转法包装慢病毒；S6.目的细胞慢病毒感染与筛选。2.根据权利要求1所述的一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，其特征是：所述S1中EGFRA289V突变的获取具体操作如下：从NCBI官网获取EGFR基因全长信息，以EGFR野生型为模板，其胞外结构域第289个氨基酸突变为EGFRA289V突变。3.根据权利要求1所述的一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，其特征是：所述S2中载体质粒双酶切具体操作如下：选用骨架为CD510B
‑1‑
pCDH
‑
CMV
‑
EF1
‑
Puro的慢病毒质粒pCDH
‑
VHL
‑
HA作为载体质粒，用限制性核酸内切酶XbaI、NotI对其进行双酶切，制备线性化载体；其反应体系在冰上配制，反应体系中包含5uLCutsmart、1uLXbaI、1uLNotI、2.5ug载体质粒，用双蒸水补齐至50ul,在37℃下过夜酶切,酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离并进行胶回收得到线性化载体。4.根据权利要求3所述的一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，其特征是：所述S3中基因特异性扩增具体操作如下：
①
设计EGFRA289V突变质粒的特异性扩增引物，引物序列为：EGFR
‑
F(5'
‑
3'):ATAGAAGATTCTAGAATGCGACCCTCCGGGAC；EGFR
‑
R(5'
‑
3'):ATCCTTCGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAAT CTGCTCCAATAAATTC；
②
PCR反应体系：其中包含25uLPfumix(2
×
)、5uL正向引物、5uL反向引物、50ngEGFRA289V突变质粒，再用双蒸水补齐至50ul；
③
PCR反应程序：调试PCR仪，使其温度在94℃维持5min，实现预变性；随后继续在94℃下维持5s实现变性；再退火至68℃下维持2.5min；在72℃下延伸5min；在72℃下再延伸5min；循环30次；
④
反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物并胶回收得到纯化的PCR扩增产物。5.根据权利要求4所述的一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，其特征是：所述S4中同源重组酶连具体操作如下：
①
同源重组反应体系：所述反应体...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕东来，费语晨，周文超，
申请(专利权)人：中国人民解放军联勤保障部队第九〇一医院，
类型：发明
国别省市：