促进猪病毒复制的MALT1稳转细胞系及其构建方法技术

本发明专利技术属于分子生物学及兽用疫苗技术领域，本发明专利技术涉及一种利用慢病毒技术在Marc

【技术实现步骤摘要】
促进猪病毒复制的MALT1稳转细胞系及其构建方法


[0001]本专利技术属于分子生物学及兽用疫苗
，具体涉及利用慢病毒技术构建种促进病毒复制的MALT1稳转细胞系的方法。

技术介绍

[0002]MALT1(Mucosa
‑
associated lymphoid tissue lymphoma translocation 1)蛋白分子包括一个N端结构域，向C端依次是两个Ig区域、一个caspase样区域以及C端的另外一个Ig区域。MALT1作为一个胞内信号蛋白在组织和器官中均有表达，是NF
‑
κB信号通路上游的胞内调控因子，可以通过调控NF
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κB信号通路的活化调控免疫和炎症反应。MALT1具有促进病毒复制的能力，MALT1可通过裂解N4BP1促进CD4+T细胞中潜伏的HIV
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1原病毒再激活，促进HIV
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1复制。在甲型流感病毒感染中，MALT1介导肺泡巨噬细胞中MMP
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9的产生，加剧流感病毒的增殖。在猪源病毒中，MALT1可以通过下调抗病毒RNA酶MCPIP1来促进PRRSV的复制，同样在PEDV感染的细胞中也可以起到促进病毒复制的作用。
[0003]单克隆细胞株筛选的目的在于获得稳定高产的细胞株，其衡量标准包括：目的蛋白表达量，代谢稳定性等，常规的筛选方法是：构建表达体——转染至宿主细胞——加压筛选获得细胞株——挑选单克隆——高表达细胞株扩大培养及筛选——细胞株的稳定性评估。
[0004]慢病毒载体是以HIV
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1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。和一般的逆转录病毒载体不同，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
[0005]猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染猪体的巨噬细胞系统，会引起机体免疫功能低下，从而引起免疫抑制。该病现还没有有效的治疗方法，一旦发病，猪存栏量急剧下降，因此防疫工作尤为重要。我国目前同时存在蓝耳病灭活疫苗和减毒活疫苗，灭活疫苗因为其效率有限，运用不广，因此以减毒活疫苗研究为主。猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起猪的腹泻、呕吐、脱水及对仔猪高致死率的一种接触性肠道传染病，猪即使耐过也会降低经济效益。目前不同阶段不同品系的猪只，对此病均有高度易感性，仔猪死亡率高达80％～100％。PED的防治始于组织灭活苗，但其保护率较差且难以控制，逐渐被淘汰。因此许多研究者致力于研究弱毒疫苗。传统的弱毒疫苗多是通过病毒细胞传代的方法制备。有学者利用在Vero细胞上传代的CV777毒株适应到PK细胞上继续传代并克隆纯化，获得了免疫原性良好且毒力减弱的弱毒株，经临床验证被动免疫和主动免疫的保护率分别达到96.2％及95.2％。无论是PRRSV还是PEDV的减毒活疫苗的制备均需要使用细胞培养，PRRSV常用非洲绿猴肾上皮细胞Marc
‑
145培养，PEDV常用Vero细胞培养。在传统细胞系中培养的病毒能达到的效价存在一定的上限，大大制约了疫苗研究的发展，导致生产成本无法降低。因此制备疫苗过程中病毒可达到的最高生产滴度关系到制备成本，提高病毒滴度可以很好的降低生产成本。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是提供一种促进猪病毒复制的MALT1稳转细胞系及其构建方法。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种促进猪病毒复制的MALT1稳转细胞系的构建方法，包括以下步骤：
[0008]1)、嘌呤霉素浓度滴定：
[0009]通过梯度滴定法确定适合Marc
‑
145或Vero细胞筛选的最佳浓度；
[0010]2)、猴源MALT1蛋白供体质粒构建：
[0011]以猴源细胞为模板扩增MALT1基因，连接至慢病毒过表达质粒CD513
‑
B，构建猴源MALT1蛋白供体质粒；
[0012]3)、猴源MALT1蛋白供体质粒与慢病毒包装质粒共转染：
[0013]将步骤2)所得的猴源MALT1蛋白供体质粒与辅助质粒共同转染293T细胞，获得慢病毒，转导至Marc
‑
145或Vero细胞中；
[0014]即，本专利技术将重组敲除载体包装成慢病毒，用慢病毒侵染受体细胞；
[0015]4)、压力筛选阳性克隆：
[0016]通过嘌呤霉素筛选，挑取单克隆细胞；
[0017]5)、阳性细胞克隆鉴定：
[0018]检测步骤4)所得阳性细胞中MALT1基因表达水平；检测方式包括荧光定量、间接免疫荧光等技术；
[0019]筛选获得稳定表达MALT1的Marc
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145细胞系或稳定表达MALT1的Vero细胞系。
[0020]本专利技术的目的蛋白MALT1编码序列如SEQ ID NO.1所示。
[0021]作为本专利技术的促进猪病毒复制的MALT1稳转细胞系的构建方法的改进，还包括步骤6)、MALT1
‑
Marc145单克隆细胞的稳定性分析：
[0022]细胞株的稳定性分析是通过将克隆筛选到的高表达细胞连续传代，各取第1代，20代，30代细胞检测MALT1基因表达情况，并且通过CCK
‑
8试剂检测各代细胞的细胞增值活性。
[0023]作为本专利技术的促进猪病毒复制的MALT1稳转细胞系的构建方法的进一步改进：
[0024]所述步骤1)中：5μg/ml浓度的puro为Marc
‑
145或Vero细胞筛选的最佳浓度。
[0025]所述步骤2)为：提取Marc
‑
145细胞RNA，根据NCBI上猴源MALT1基因序列，设计扩增MALT1引物，PCR扩增得到目的片段，将测序分析正确的质粒与慢病毒表达载体CD513
‑
B重组连接，转入感受态细胞重组表达，获得了猴源MALT1重组慢病毒质粒。
[0026]所述步骤3)为：使用Lipofectamine
TM
转染试剂(Invitrogen)将步骤2)所得的猴源MALT1蛋白供体质粒与三种辅助质粒共转染到HEK293T细胞中，在转染48
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72小时后收集病毒上清液，将病毒上清液转导至密度为60％的Marc
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145或Vero细胞中；
[0027]三种辅助质粒为pGag/Pol,pRev,pVSVG；猴源MALT1重组慢病毒载体与pGag/Pol,pRev,pVSVG的质量比为3：1：1：1。
[0028]所述步骤4)为：步骤3)所得的转导细胞生长48h后，细胞培养基更换为含5μg/ml puro的含10％ FBS的DMEM培养基，该培养基间隔1天换液一次，每天观察细胞生长状态；压力筛选至8d后，梯度稀释法挑取单克隆细胞。
[0029]所述步骤5)为：收集步骤4)所得的部分阳本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进猪病毒复制的MALT1稳转细胞系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)、嘌呤霉素浓度滴定：通过梯度滴定法确定适合Marc
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145或Vero细胞筛选的最佳浓度；2)、猴源MALT1蛋白供体质粒构建：以猴源细胞为模板扩增MALT1基因，连接至慢病毒过表达质粒CD513
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B，构建猴源MALT1蛋白供体质粒；3)、猴源MALT1蛋白供体质粒与慢病毒包装质粒共转染：将步骤2)所得的猴源MALT1蛋白供体质粒与辅助质粒共同转染293T细胞，获得慢病毒，转导至Marc
‑
145或Vero细胞中；4)、压力筛选阳性克隆：通过嘌呤霉素筛选，挑取单克隆细胞；5)、阳性细胞克隆鉴定：检测步骤4)所得阳性细胞中MALT1基因表达水平；筛选获得稳定表达MALT1的Marc
‑
145细胞系或稳定表达MALT1的Vero细胞系。2.根据权利要求1所述的促进猪病毒复制的MALT1稳转细胞系的构建方法，其特征在于还包括步骤6)、MALT1
‑
Marc145单克隆细胞的稳定性分析：细胞株的稳定性分析是通过将克隆筛选到的高表达细胞连续传代，各取第1代，20代，30代细胞检测MALT1基因表达情况，并且通过CCK
‑
8试剂检测各代细胞的细胞增值活性。3.根据权利要求1或2所述的促进猪病毒复制的MALT1稳转细胞系的构建方法，其特征在于所述步骤1)中：5μg/ml浓度的puro为Marc
‑
145或Vero细胞筛选的最佳浓度。4.根据权利要求3所述的促进猪病毒复制的MALT1稳转细胞系的构建方法，其特征在于所述步骤2)为：提取Marc
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145细胞RNA，根据NCBI上猴源MALT1基因序列，设计扩增MALT1引物，PCR扩增得到目的片段，将测序分析正...

【专利技术属性】
技术研发人员：何放，郑素雅，顾晗，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：