一种适用于构建鲤科鱼稳转细胞系的慢病毒包装系统及应用技术方案

本发明专利技术属于遗传育种领域中的分子遗传学研究领域，公开了一种适用于构建淡水鱼稳转细胞系的慢病毒包装系统及应用。该方法简单高效，适用于所有鲤科鱼类稳转细胞系的构建和性状相关基因的功能研究。采用这一方法，结合流式细胞筛选，我们建立了两个稳定转入绿色荧光蛋白（GFP）基因的草鱼肾脏（CIK）细胞系。本发明专利技术提供的优化后的慢病毒包装系统可用于草鱼经济性状相关基因的转基因功能研究和遗传机制解析，也可以解决鲤科鱼类的转基因家系高效构建的问题。建的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于构建鲤科鱼稳转细胞系的慢病毒包装系统及应用


[0001]本专利技术属于遗传育种领域中的分子遗传学研究领域，具体涉及一种适用于构建鲤科鱼稳转细胞系的慢病毒包装系统及应用。

技术介绍

[0002]传统构建稳转细胞株的方法主要是通过转染试剂和逆转录病毒介导，转染试剂中使用较多的是基于脂质体的转染试剂，如LIP2000和LIP3000等，逆转录病毒中使用较多的则是慢病毒系统。基于脂质体的转染试剂和慢病毒系统在哺乳动物细胞，特别是293T细胞中转染效率很高，是建立哺乳动物稳转细胞株的两种主流方法。
[0003]目前在鱼类细胞，特别是在淡水鱼细胞做转染时，主要使用的是基于脂质体的转染试剂。但由于鱼类细胞的生长模式和培养条件与哺乳动物细胞存在较大差异，基于脂质体的转染方法在鱼类细胞中转染效率低，整合入细胞基因组的效率更低，因此利用现有方法，构建鱼类稳转细胞系较为困难。原因有以下两个方面：
①
鱼类细胞培养环境温度较低，代谢较慢，脂质体转染效率低；
②
脂质体转染需要无血清环境，但无血清环境对鱼类细胞的毒性高，造成细胞存活率低。
[0004]慢病毒载体(Lentiviral vectors,LVs)是在HIV
‑
1基础上去掉有害基因但保留其感染性，从而改造成的病毒载体系统，它能高效地将目的基因导入人的原代细胞或细胞系，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。已有一些水产领域从事分子生物学研究的人员，试图将慢病毒系统应用于鱼类转基因细胞株的构建，但并未针对系统中的质粒进行增强感染性方面的改造，目前还没有构建高效鱼类慢病毒系统质粒的报道。推测主要原因是可购买的慢病毒包装系统，虽然其感染普广，但主要侵染范围还是来源于哺乳类的各类细胞，如神经细胞、肝细胞、心肌细胞、内皮细胞、干细胞、原代细胞等，并不能高效进入鱼的细胞。
[0005]针对上述问题，申请人提供了一种适用于构建草鱼或鲤鱼稳转细胞系的慢病毒包装系统，该系统可直接用于经济鱼类相关基因的转基因功能研究，也可以解决淡水鱼类的转基因家系高效构建的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种适用于构建鲤科鱼稳转细胞系的慢病毒包装系统，所述的包装系统包括：改造的pMD2.G，改造的pLenti CMV/TO eGFP Puro和psPAX2质粒，所述的改造的pMD2.G质粒是将pMD2.G质粒中的水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV
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G)基因替换为密码子优化后的鲤春病毒糖蛋白(SVCV
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G)基因或草鱼弹状病毒糖蛋白(GrCRV
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G)基因；改造的pLenti CMV/TO eGFP Puro质粒是将pLenti CMV/TO eGFP Puro质粒中的两个LTR序列替换为斑马鱼内源性逆转录病毒(ZFERV)中的转座子序列(zLTR)。
[0007]本专利技术的另一个目的在于提供上述慢病毒包装系统在构建鲤科鱼稳转细胞系中的应用。
[0008]本专利技术还有一个目的在于提供上述慢病毒包装系统在构建转基因鲤科鱼家系中的应用。
[0009]本专利技术最后一个目的在于提供上述慢病毒包装系统在鲤科鱼相关基因功能研究中的应用。
[0010]为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
[0011]鲤科鱼稳转细胞系的慢病毒包装系统的构建思路：
[0012]申请人在前期实验过程中发现，利用商品化的三质粒慢病毒包装系统，对淡水鱼，例如草鱼，鲤鱼，斑马鱼等的转染效率极低，甚至出现不转染的情况。因此，申请人考虑到鱼类细胞和哺乳动物细胞的差异，将三质粒系统中的pMD2.G质粒中的水疱性口炎病毒糖蛋白基因(VSV
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G)替换为感染目标鱼病毒的糖蛋白基因。由于宿主差异，因此需要对替换后糖蛋白基因进行优化，由于软件推荐的优化后的基因导入后，并不能很好的实现转染，因此申请人利用生物信息学进行计算，进行基因的手动优化，同时对pLenti CMV/TO eGFP Puro质粒的转座子元件进行了改造，替换为鱼类逆转录病毒的转座子序列。最终，获得了鲤科鱼的稳转细胞系的慢病毒包装系统。
[0013]本专利技术所述的鲤科鱼的稳转细胞系的慢病毒包装系统，包括pMD
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SVCV
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G质粒或pM D
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GrCRV
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G质粒、pLenti CMV/TO eGFP Puro zLTR质粒，和psPAX2，所述的pMD
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SVC V
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G质粒是将pMD2.G质粒中的水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV
‑
G)基因替换为密码子优化后的鲤春病毒糖蛋白(SVCV
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G)基因；所述的pMD
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GrCRV
‑
G质粒是将pMD2.G质粒中的水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV
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G)基因替换为密码子优化后的草鱼弹状病毒糖蛋白(GrCR V
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G)基因；所述的pLenti CMV/TO eGFP Puro zLTR质粒是将pLenti CMV/TO eGFP Pu ro质粒中的两个LTR序列替换为斑马鱼内源性逆转录病毒(ZFERV)中的转座子序列(zL TR)。pMD
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SVCV
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G质粒的多核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，pMD
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GrCRV
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G质粒的多核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，pLenti CMV/TO eGFP Puro zLTR质粒的多核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。psPAX2是商业化质粒。
[0014]本专利技术的保护内容还包括：
[0015]上述慢病毒包装系统在构建鲤科鱼稳转细胞系中的应用。
[0016]上述慢病毒包装系统在构建转基因鲤科鱼家系中的应用。
[0017]上述慢病毒包装系统在鲤科鱼相关基因功能研究中的应用。
[0018]上述应用的应用方法，包括将pMD
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SVCV
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G质粒或pMD
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GrCRV
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G质粒、pLenti CM V/TO eGFP Puro zLTR质粒或改造的pLenti CMV/TO eGFP Puro zLTR质粒，和psPAX2形成的转染复合物转染293T细胞进行病毒包装后，再转染鲤科鱼细胞；
[0019]所述的改造的pLenti CMV/TO eGFP Puro zLTR质粒，是将目的基因与pLenti CMV/TO eGFP Puro zLTR中的GFP融合，或者替换。
[0020]本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0021]本专利技术对已有的商业化慢病毒包装质粒进行多质粒元件优化，包装出可高效感染草鱼CIK细胞的慢病毒颗粒。本专利技术方法主要具有两个优点：
[0022]①
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种适用于构建鲤科鱼稳转细胞系的慢病毒包装系统，包括pMD
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SVCV
‑
G质粒或pMD
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GrCRV
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G质粒、pLenti CMV/TO eGFP Puro zLTR质粒，和psPAX2，所述的pMD
‑
SVCV
‑
G质粒是将pMD2.G质粒中的水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV
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G）基因替换为密码子优化后的鲤春病毒糖蛋白（SVCV
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G）基因；所述的pMD
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GrCRV
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G质粒是将pMD2.G质粒中的水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV
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G）基因替换为密码子优化后的草鱼弹状病毒糖蛋白（GrCRV
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G）基因；所述的pLenti CMV/TO eGFP Puro zLTR质粒是将pLenti CMV/TO eGFP Puro质粒中的两个LTR序列替换为斑马鱼内源性逆转录病毒（ZFERV）中的转座子序列（zLTR）。2. 根据权利要求1所述的慢病毒包装系统，所述的pMD
‑
SVCV...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄容，谢巨宏，李勇明，桂彬，杨诚，廖兰杰，汪亚平，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：