一种基因编辑的动物成体肝癌模型的构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基因编辑的动物成体肝癌模型的构建方法和应用，涉及肝癌细胞动物模型构建技术领域；该方法先扩增、培养动物成体肝干细胞，保存；然后将过表达Yap重组质粒，以及可敲除抑癌基因PTEN的CRISPR/Cas9重组质粒配制成注射液，共同转染到动物成体的肝干细胞中；所述过表达Yap重组质粒和可敲除抑癌基因PTEN的CRISPR/Cas9重组质粒的质量比为1:(0.5

【技术实现步骤摘要】
一种基因编辑的动物成体肝癌模型的构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及肝癌细胞动物模型构建
，特别涉及基因编辑的动物成体肝癌模型的构建方法。

技术介绍

[0002]实验动物作为“活的试剂”、“人的替身”，是生命科学研究和生物技术发展的重要支撑条件，在人类疾病的发病机理、诊断、治疗、预防、生物医药和生物制品的生产与质量评价，以及与人类生存环境密切相关的重大研究方面发挥了巨大的作用。
[0003]肝细胞肝癌(HCC)是最为常见的肝脏原发性恶性病变，近年来其死亡率呈逐渐增长趋势。肝内胆管细胞癌(ICC)是起源于二级胆管及其分支上皮的腺癌，约占肝脏原发恶性肿瘤的10％
‑
15％，是发病率仅次于HCC的肝脏原发恶性肿瘤，近年来发病率同样呈上升趋势。HCC、ICC起病隐匿，早期无明显临床症状，许多患者在确诊时已是中晚期，失去手术治疗的机会，靶向治疗药物较少而且预后相对较差。因此对HCC和ICC的早期诊断和及时治疗非常重要。基于此，与之相关的动物成体肝癌模型的构建技术变得至关重要。
[0004]传统的转基因或基因编辑敲除技术，对动物模型的生存周期会造成一定影响。化学诱导法构建的肝癌模型耗时长，且发病机理研究难度大。因此，如何构建耗时短，成功率高，更易存活的动物成体肝癌模型，成为了业界亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种基因编辑的动物成体肝癌模型的构建方法和应用，具体通过以下技术实现。
[0006]一种基因编辑的动物成体肝癌模型的构建方法，包括以下步骤：
[0007]S1、扩增、培养动物成体肝干细胞，保存；
[0008]S2、将过表达Yap重组质粒，以及可敲除抑癌基因PTEN的CRISPR/Cas9重组质粒配制成注射液，共同转染到动物成体的肝干细胞中；所述过表达Yap重组质粒和可敲除抑癌基因PTEN的CRISPR/Cas9重组质粒的质量比为1:(0.5～2)；
[0009]S3、正常饲养动物成体，筛选抑癌基因PTEN被敲除并且过表达Yap的动物成体，即获得PTEN基因缺失且Yap过表达的动物成体肝癌模型。优选地，步骤S2中，所述注射液为含有过表达Yap重组质粒，以及可敲除抑癌基因PTEN的CRISPR/Cas9重组质粒的生理盐水溶液，所述注射液的用量为动物成体体重的10
‑
11％。
[0010]更优选地，所述注射液中过表达Yap重组质粒和可敲除抑癌基因PTEN的CRISPR/Cas9重组质粒的用量均为5μg。
[0011]优选地，步骤S3中，饲养动物成体的时间为15
‑
22周。
[0012]本专利技术还提供了用于构建杉树动物成体肝癌模型的质粒组合，包含过表达Yap重组质粒和可敲除抑癌基因PTEN的CRISPR/Cas9重组质粒。
[0013]本专利技术还限定了采用上述构建方法构建的PTEN基因缺失且Yap过表达的动物成体
肝癌模型，用于研究药物对PTEN基因缺失且Yap过表达的动物成体肝癌模型的抗癌机制，筛选抗癌药物。
[0014]与现有技术相比，本专利技术的有益之处在于：本专利技术提供了一种PTEN缺失协同Yap过表达癌基因小鼠肝癌模型的构建方法，相比于现有的动物模型构建技术构建效率高。
附图说明
[0015]图1为构建成功的HCC和ICC混合型肝癌的小鼠动物模型；
具体实施方式
[0016]下面将对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0017]实施例1：敲除小鼠的抑癌基因pten的重组质粒，以及过表达Yap重组质粒的构建
[0018]按照下表1所示的酶切体系使用限制性内切酶BsmBI对慢病毒质粒进行酶切，作为构建敲除小鼠的抑癌基因PTEN、过表达Yap重组质粒的慢病毒重组质粒的基础载体；其中酶切条件为：在55℃条件下酶切反应15min后，80℃酶失活20min，酶切产物进行1％琼脂糖电泳，可见在2kb处有条带，即获得目的线性化的慢病毒重组质粒，回收目的载体条带保存于
‑
20℃备用。
[0019]表1限制性内切酶BsmBI对慢病毒重组质粒进行酶切的体系
[0020] 用量，μLBsmBI2慢病毒重组质粒510
×
Buffer5H2O38总计50
[0021]设计针对小鼠Pten基因和Yap过表达的sgRNA。分别将抑癌基因PTEN和Yap的sgRNA用T4多聚核苷酸激酶在5
’
端添加磷酸基团，反应体系如下表2所示；反应条件为：37℃温育30min，然后95℃5min，以2℃/min降温，直至25℃，得到退火后的低聚物。
[0022]表2sgRNA的5
’
端添加磷酸基团的反应体系
[0023][0024]将上述方法获得的低聚物稀释到无菌水中，按照下表4的反应体系加入T4连接酶分别将PTEN、Yap的sgRNA(在5
’
端已添加磷酸基团)连接至慢病毒重组载体中，T4连接反应
条件为：4℃连接过夜；随后将连接产物转化到感受态细胞，挑取阳性克隆增菌后进行序列测定，成功构建了敲除小鼠的抑癌基因pten的慢病毒重组质粒sgPTEN和过表达Yap的慢病毒重组质粒pT3
‑
EF1α
‑
Yap。
[0025]实施例2：诱发型炎癌转化小鼠模型的构建
[0026]将上述实施例1的利用CRISPR技术制备PTEN基因缺失质粒(sgPTEN)，然后将质粒溶液pCMV/SB(2μg)分别与sgPTEN(20μg)、pT3
‑
EF1α
‑
Yap(30μg)用生理盐水稀释后，以FVB/N成年小鼠体重(g)10％的注射液体总量(mL)，在7
‑
9秒内通过尾静脉注射至小鼠体内，分别得到WT(野生型)、sgPTEN、Yap和sgPTEN/Yap四组，每组10只。定期观察实验组小鼠，记录可以触诊到肿瘤形成的时间。当小鼠肿瘤负荷较大和精神萎靡时，在麻醉状态下通过颌下静脉丛收集小鼠血液，离心后取上层血清，置于
‑
80℃保存备用。处死小鼠，分离肿瘤，称重，测量计算体积并拍照，分离的肿瘤冷冻，保存备用。统计分析生存曲线、肝脏重量、肝脏指数的变化。
[0027]结果：小鼠单独转染sgPTEN或Yap22周没有肿瘤形成，sgPTEN小鼠肝脏出现少许脂肪化；同时转染sgPTEN和Yap时，小鼠在15.5
‑
22周形成致命的肿瘤负荷，经过病理学、肿瘤标志物和生化指标检测确定该肿瘤为HCC和ICC混合型肝癌，如图1所示。
[0028]以上具体实施方式详细描述了本专利技术的实施，但是，本专利技术并不限于上述实施方式中的具体细节。在本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因编辑的动物成体肝癌模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、扩增、培养动物成体肝干细胞，保存；S2、将过表达Yap重组质粒，以及可敲除抑癌基因PTEN的CRISPR/Cas9重组质粒配制成注射液，共同转染到动物成体的肝干细胞中；所述过表达Yap重组质粒和可敲除抑癌基因PTEN的CRISPR/Cas9重组质粒的质量比为1:(0.5～2)；S3、正常饲养动物成体，筛选抑癌基因PTEN被敲除并且过表达Yap的动物成体，即获得PTEN基因缺失且Yap过表达的动物成体肝癌模型。2.根据权利要求1所述的基因编辑的动物成体肝癌模型的构建方法，其特征在于，步骤S2中，所述注射液为含有过表达Yap重组质粒，以及可敲除抑癌基因PTEN的CRISPR/Cas9重组质粒的生理盐水溶液，所述注射液的用量为动物...

【专利技术属性】
技术研发人员：寇桓，靖超，
申请(专利权)人：武汉贝赛模式生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：