【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及心肌细胞分离，更具体的，涉及一种高效且具有普适性的小鼠心肌细胞分离缓冲液及其应用。
技术介绍
1、心血管疾病是全球致死率最高的疾病之一，心肌细胞的损伤或死亡是其主要病理过程。因此，对心肌细胞进行深入研究，了解其生理和病理特性，是心血管疾病防治的关键。然而，现有技术中小鼠心肌细胞的分离方法存在步骤繁杂、耗时长、成功率低等问题，严重制约了相关领域的研究进展。因此，开发一种高效且具有普适性小鼠心肌细胞的分离缓冲液及分离方法具有重要的实际应用价值。
2、目前，小鼠心肌细胞的分离方法主要包括酶解法、研磨法、差速离心法等。然而，这些方法都存在一些问题。例如，酶解法的酶解过程可能对细胞造成损伤，影响细胞的活性；研磨法则可能造成细胞的污染，影响后续的研究；差速离心法则难以将心肌细胞和其他类型的细胞有效分离。因此，需要一种能够克服这些缺点的新型心肌细胞分离方法，并适用于出生后不同年龄段小鼠心肌细胞的体外分离方法。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，提供一种高效且具有普适性的小鼠心肌细胞分离缓冲液。本专利技术是关于出生后不同年龄段小鼠心肌细胞体外分离的方法，进而获得纯度高、活性好且形态佳的心肌细胞。
2、本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
3、一种小鼠心肌细胞分离缓冲液，其特征在于，所述缓冲液的组成为：0.5mg/ml ii型胶原酶、0.00025-0.0005mg/ml dnase i、0.15mg/m
4、本专利技术还提供所述缓冲液在分离小鼠心肌细胞中的应用。
5、本专利技术还提供一种用于分离小鼠心肌细胞的缓冲液组合，由所述的分离缓冲液、edta缓冲液和perfusion缓冲液组成。
6、其中edta缓冲液用于心肌组织的松解，perfusion缓冲液起到类似冲洗，隔断edta缓冲液的作用，collagenase起到消化作用。在collagenase缓冲液中，ii型胶原酶含有更高的梭菌蛋白酶活性，通常用于心脏等组织来源细胞的制备，由于心脏中细胞外基质(ecm)是够成细胞的骨架，其主要成分为胶原和弹性蛋白，因此胶原酶是消化心脏组织的首选消化酶；蛋白酶(protease xiv)使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散；dnase i是一种可以消化单链或双链dna的非特异性核酸内切酶，在细胞培养中可以用来消化细胞间黏连。
7、针对于ii型胶原酶的特性，上述缓冲液适用于用于心脏、骨、肌肉、肝、甲状腺和软骨等组织来源的原代细胞制备，本专利技术中使用的collagenase缓冲液也可用于除心脏心肌细胞分离外，骨、肌肉、肝、甲状腺和软骨等组织来源的原代细胞制备，缓冲液中的组分配比需要根据不同的组织进行相应的调整。
8、优选的，所述edta缓冲液的组成为：7.5972g/l nacl、0.37275g/l kcl、0.05999g/lnah2po4、2.383g/l hepes、1.8016g/l glucose、1.011g/lbdm、1.2515g/ltaurine、1.4612g/l edta，ph值为7.8；
9、优选的，所述perfusion缓冲液的组成为：7.5972g/lnacl、0.37275g/lkcl、0.05999g/lnah2po4、2.383g/l hepes、1.8016g/l glucose、1.011g/lbdm、1.2515g/ltaurine、0.095g/lmgcl2，ph值为7.8。
10、优选的，出生3天的小鼠心肌细胞分离缓冲液的组成为：0.5mg/ml ii型胶原酶、0.00025mg/ml dnase i、0.15mg/ml protease xiv。
11、优选的，出生7天的小鼠心肌细胞分离缓冲液的组成为：0.5mg/ml ii型胶原酶、0.0005mg/ml dnase i、0.15mg/ml protease xiv。
12、优选的，出生10天的小鼠心肌细胞分离缓冲液的组成为：0.5mg/ml ii型胶原酶、0.0005mg/ml dnase i、0.15mg/ml protease xiv。
13、本专利技术还提供种高效且具有普适性小鼠心肌细胞的分离方法，解决现有技术中的问题。具有更广的适用范围，该方法包括以下步骤：
14、s1、采用吸入麻醉小鼠后，剪开胸腔后，用注射器于右心室入针，缓慢匀速灌注5mledta缓冲液至液体清亮；
15、s2、使用缝合线沿心脏根部结扎心脏并剪下，置于6cm培养皿内，用注射器于心尖处入左心室，缓慢匀速灌注5ml edta缓冲液；
16、s3、将心脏置于新的6cm培养皿内，于左心室缓慢匀速灌注5ml perfusion缓冲液，冲洗心脏；
17、s4、于新的6cm培养皿内，于左心室缓慢匀速灌注10ml collagenase缓冲液，灌注完成后，用组织镊将心脏组织钝性分离成1-3mm3的碎块，小心吹打组织碎块成尽量多的单细胞悬液；
18、s5、加入终止消化缓冲液，后于100um网筛过滤未消化的组织块；
19、s6、于镜下观察分离后获得的细胞状态；
20、s7、于室温静置沉降20min，去除上清，获得心肌细胞；于镜下观察分离的心肌细胞的状态。
21、步骤s5终止消化缓冲液的组成为：5％fbs，perfusion缓冲液，需现配现用。
22、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
23、本专利技术提供了一种高效且具有普适性的小鼠心肌细胞分离缓冲液及其分离方法，该方法操作简单，耗时短，心肌细胞分离效率高，对细胞活性影响小，成功率显著提高，并且该方法中所使用的collagenase缓冲液从多方面提高了心肌细胞的分离效率，并且调整组分中的不同浓度比即可适用于更宽范围的年龄段小鼠心肌细胞分离，在实际操作中实现“一物多用，节约成本”。能够满足各种需要小鼠心肌细胞的实验要求，具有广泛的实际应用价值。此外，该方法还可以为研究心肌细胞生理功能、心脏发育中心肌细胞的作用及功能及心脏疾病的发病机制中心肌细胞的作用及功能提供更好的技术支持，促进相关领域的发展。
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1.一种小鼠心肌细胞分离缓冲液，其特征在于，所述缓冲液的组成为：0.5mg/ml II型胶原酶、0.00025-0.0005mg/ml Dnase I、0.15mg/ml Protease XIV。
2.权利要求1所述缓冲液在分离小鼠心肌细胞中的应用。
3.一种用于分离小鼠心肌细胞的缓冲液组合，其特征在于，由权利要求1所述的分离缓冲液、EDTA缓冲液和Perfusion缓冲液组成。
4.根据权利要求3所述的缓冲液组合，其特征在于，所述EDTA缓冲液的组成为：7.5972g/LNaCl、0.37275g/L KCl、0.05999g/LNaH2PO4、2.383g/L HEPES、1.8016g/LGlucose、1.011g/LBDM、1.2515g/LTaurine、1.4612g/L EDTA，pH值为7.8；
5.根据权利要求4所述的缓冲液组合，其特征在于，出生3天的小鼠心肌细胞分离缓冲液的组成为：0.5mg/ml II型胶原酶、0.00025mg/ml Dnase I、0.15mg/ml Protease XIV。
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1.一种小鼠心肌细胞分离缓冲液，其特征在于，所述缓冲液的组成为：0.5mg/ml ii型胶原酶、0.00025-0.0005mg/ml dnase i、0.15mg/ml protease xiv。
2.权利要求1所述缓冲液在分离小鼠心肌细胞中的应用。
3.一种用于分离小鼠心肌细胞的缓冲液组合，其特征在于，由权利要求1所述的分离缓冲液、edta缓冲液和perfusion缓冲液组成。
4.根据权利要求3所述的缓冲液组合，其特征在于，所述edta缓冲液的组成为：7.5972g/lnacl、0.37275g/l kcl、0.05999g/lnah2po4、2.383g/l hepes、1.8016g/lglucose、1.011g/lbdm、1.2515g/ltaurine、1...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟庆航，乔燕，密琼洁，
申请(专利权)人：粤港澳大湾区精准医学研究院广州，
类型：发明
国别省市：
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