一种遗传工程外泌体介导的细胞膜蛋白降解方法技术

本发明专利技术提供了一种遗传工程外泌体介导的细胞膜蛋白降解方法，分别构建靶向ASGPR蛋白的质粒、靶向PDL1或HER2蛋白的质粒；使靶向ASGPR蛋白的质粒、靶向PDL1或HER2蛋白的质粒表达在外泌体上构建遗传工程外泌体；通过溶酶体靶向降解途径靶向降解肿瘤细胞表面蛋白。本发明专利技术通过不同工程化外泌体，运用LYTACs途径靶向降解PD

【技术实现步骤摘要】
一种遗传工程外泌体介导的细胞膜蛋白降解方法


[0001]本专利技术属于生物医学领域中的检测方法，尤其涉及一种遗传工程外泌体介导的细胞膜蛋白降解方法。

技术介绍

[0002]外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外基质中的膜性囊泡，它是一种广泛存在于血液、唾液、尿液和母乳中，直径为30
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150nm的纳米级脂质包裹体结构。因其较脂质体材料有较好的生物相容性，所以多在药物递送领域有广泛的应用。
[0003]溶酶体靶向嵌合体(LYTACs)是由一个小分子或融合到化学合成的糖肽配体上的抗体组成。去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)是肝细胞特异性表达的受体，该受体可以介导内吞并靶向至溶酶体中。研究表明ASGPR可以识别含有半乳糖配体的糖蛋白，并通过网格蛋白介导的内吞作用将其内化，在内化和经过内涵体酸化后，ASGPR释放半乳糖配体并循环至细胞膜上，而糖蛋白则继续进入溶酶体。靶蛋白降解策略还有蛋白水解靶向嵌合体(PROTACs)策略，是通过双功能的分子，一端结合靶蛋白配体，另一端连接E3连接酶形成三元复合物，使靶蛋白泛素化从而被细胞内的蛋白酶体识别并讲解。但PROTACs也具有如脱靶毒性，蛋白质活性位点选择性差以及缺少泛素化结构与等局限性。而外泌体可以从细胞培养液，组织液等液体中获得，通过对外泌体进行药物装载和表面修饰后进行个性化治疗可以降低免疫反应。
[0004]细胞程序性死亡配体(PD
‑
L1)是一种广泛表达于肿瘤细胞表面的蛋白。它可以与免疫细胞上的免疫检查点程序性死亡受体1(PD
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1)互相结合，降低免疫细胞的活性，从而抑制免疫细胞对肿瘤的攻击，使肿瘤细胞得以存活。因此通过抑制PD
‑
L1的表达可以在一定程度上促进免疫细胞对肿瘤细胞的攻击，在肿瘤治疗上具有一定的潜力。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术中通过传统的化合物小分子靶向降解PD
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L1而造成的高毒性以及生物不相容性等方面的不足，提供一种基于工程化外泌体靶向降解蛋白的研究方法。该方法通过不同工程化外泌体，分别运用LYTACs途径靶向降解PD
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L1/HER2，实现了以一种低毒性，生物相容性更好的方式降解特定蛋白。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供了一种遗传工程外泌体介导的细胞膜蛋白降解方法，通过构建不同的靶向蛋白的质粒使其表达在外泌体上，将工程化的外泌体与不同的肿瘤细胞按照不同时间不同浓度孵育，分别利用溶酶体靶向嵌合体方法，蛋白质水解靶向抗体方法以及细胞因子受体靶向嵌合体方法介导肿瘤细胞表面的PD
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L1/HER2蛋白降解。并通过免疫荧光成像，流式细胞术以及Western blot技术评估PD
‑
L1或HER2的降解程度。
[0007]具体方法为：一种遗传工程外泌体介导的细胞膜蛋白降解方法，分别构建靶向ASGPR蛋白的质粒、靶向PDL1蛋白的质粒；使所述靶向ASGPR蛋白的质粒、靶向PDL1蛋白的质粒表达在外泌体上构建遗传工程外泌体；将所述遗传工程外泌体与肿瘤细胞孵育，介导肿
瘤细胞表面蛋白降解；
[0008]所述靶向ASGPR蛋白的质粒的序列如SEQ ID NO.1所示；
[0009]所述靶向PDL1蛋白的质粒的序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]一种遗传工程外泌体介导的细胞膜蛋白降解方法，分别构建靶向ASGPR蛋白的质粒、靶向HER2蛋白的质粒；使所述靶向ASGPR蛋白的质粒、靶向HER2蛋白的质粒表达在外泌体上构建遗传工程外泌体；将所述遗传工程外泌体与肿瘤细胞孵育，介导肿瘤细胞表面蛋白降解；
[0011]所述靶向ASGPR蛋白的质粒的序列如SEQ ID NO.1所示；
[0012]所述靶向HER2蛋白的质粒的序列如SEQ ID NO.3所示。
[0013]上述的遗传工程外泌体介导的细胞膜蛋白降解方法，进一步的，包括以下步骤：
[0014]S1、将所述靶向ASGPR蛋白的质粒和靶向PDL1蛋白的质粒稳定表达在293T细胞中，或将所述靶向ASGPR蛋白的质粒和靶向HER2蛋白的质粒稳定表达在293T细胞中，收集细胞上清，通过超速离心提取外泌体；
[0015]S2、将所述外泌体与肿瘤细胞进行孵育。
[0016]上述的遗传工程外泌体介导的细胞膜蛋白降解方法，进一步的，所述S1具体为：
[0017]S1
‑
A1、将构建的靶向ASGPR蛋白的质粒、靶向PDL1蛋白的质粒与PAX、PMD、p3000进行混合包装获得慢病毒；
[0018]S1
‑
A2、用所述慢病毒感染293T细胞；
[0019]S1
‑
A3、收集稳定表达质粒的293T细胞培养基上清，进行离心分离获得外泌体。
[0020]上述的遗传工程外泌体介导的细胞膜蛋白降解方法，进一步的，所述S1具体为：
[0021]S1
‑
B1、将构建的靶向ASGPR蛋白的质粒、靶向HER2蛋白的质粒与PAX、PMD、p3000进行混合包装获得慢病毒；
[0022]S1
‑
B2、用所述慢病毒感染293T细胞；
[0023]S1
‑
B3、收集稳定表达质粒的293T细胞培养基上清，进行离心分离获得外泌体。
[0024]上述的遗传工程外泌体介导的细胞膜蛋白降解方法，进一步的，所述S2中所述肿瘤细胞为肝癌细胞HepG2，乳腺癌细胞MCF
‑
7，人宫颈癌细胞Hela。
[0025]上述的遗传工程外泌体介导的细胞膜蛋白降解方法，进一步的，所述S2中将所述外泌体与肿瘤细胞进行孵育，具体为：将所述外泌体与肿瘤细胞孵育3h～9h；所述外泌体的浓度为0.1μg/μL～0.3μg/μL。
[0026]与现有技术相比，本专利技术的优点在于：
[0027]本专利技术提供了一种基于工程化外泌体的溶酶体靶向降解蛋白的研究方法，相较于现有技术中的溶酶体靶向降解蛋白研究，本专利技术利用外泌体可降低化合物小分子对于细胞的毒副作用，具有更好的生物相容性。
附图说明
[0028]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0029]图1为本专利技术实施例4的原理图。
[0030]图2为本专利技术实施例4中质粒的表达共聚焦成像图。
[0031]图3为本专利技术实施例4中验证流式细胞术结果图。
[0032]图4为本专利技术实施例4中外泌体提取及表征结果图。
[0033]图5为本专利技术实施例4中验证表达不同质粒的外泌体与不同的肿瘤细胞按照不同的时间，不同浓度进行孵育时的外泌体内吞共聚焦成像图。
[0034]图6是本专利技术实施例4中HepG2细胞按照不同浓度孵育共转外泌体5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种遗传工程外泌体介导的细胞膜蛋白降解方法，其特征在于，分别构建靶向ASGPR蛋白的质粒、靶向PDL1蛋白的质粒；使所述靶向ASGPR蛋白的质粒、靶向PDL1蛋白的质粒表达在外泌体上构建遗传工程外泌体；通过溶酶体靶向降解途径靶向降解肿瘤细胞表面蛋白；所述靶向ASGPR蛋白的质粒的序列如SEQ ID NO.1所示；所述靶向PDL1蛋白的质粒的序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种遗传工程外泌体介导的细胞膜蛋白降解方法，其特征在于，分别构建靶向ASGPR蛋白的质粒、靶向HER2蛋白的质粒；使所述靶向ASGPR蛋白的质粒、靶向HER2蛋白的质粒表达在外泌体上构建遗传工程外泌体；通过溶酶体靶向降解途径靶向降解肿瘤细胞表面蛋白；所述靶向ASGPR蛋白的质粒的序列如SEQ ID NO.1所示；所述靶向HER2蛋白的质粒的序列如SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求1或2所述的遗传工程外泌体介导的细胞膜蛋白降解方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将所述靶向ASGPR蛋白的质粒和靶向PDL1蛋白的质粒稳定表达在293T细胞中，或将所述靶向ASGPR蛋白的质粒和靶向HER2蛋白的质粒稳定表达在293T细胞中，收集细胞上清，通过超速离心提取外泌体；S2、将所述外泌体与肿瘤细胞进行孵育。4.根据权利要求3所述的遗传工程外泌体介导的细胞膜蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺建军，蒋健晖，王韬，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：