一种脐血iNKT细胞体外扩增和诱导活化的方法及应用技术

本发明专利技术涉及再生医学和生物学技术领域，尤其涉及一种脐血iNKT细胞体外扩增和诱导活化的方法及应用。方法包括以下步骤：扩增阶段：从脐血中获得含有iNKT细胞的脐血浆重悬细胞沉淀，细胞培养瓶中，加入1640基础培养基、IL

【技术实现步骤摘要】
一种脐血iNKT细胞体外扩增和诱导活化的方法及应用


[0001]本专利技术涉及再生医学和生物学
，尤其涉及一种脐血iNKT细胞体外扩增和诱导活化的方法及应用。

技术介绍

[0002]自然杀伤T细胞(Nature killer T cell，NKT)是在T淋巴细胞发育早期分支出的新的特殊类型的T淋巴细胞亚群，是具有特定标志的T细胞亚群，表达T细胞及自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)双重标志。在先天固有性免疫和后天适应性免疫中均发挥重要作用。NKT细胞通常可分为三型：Ⅰ型NKT：具有CD1d限制性，表达一条恒定的TCR
‑
α链(人Vα24)和一条限制性TCR
‑
β链(人Vβ11)，具有恒定性，故称恒定性NKT(invariant NKT，iNKT)，又称经典性NKT；Ⅱ型NKT：具有CD1d限制性，但表达非恒定TCR
‑
αβ链，又称多样性NKT(diverse NKT，dNKT)，或非经典性NKT，表达多种不同的TCR
‑
αβ链，在抗肿瘤免疫中，它们的作用与Ⅰ型NKT互相拮抗，是一种抑制免疫监视的细胞，并可通过分泌IL
‑
13发挥抑制肿瘤免疫的作用；Ⅲ型NKT：是非CD1d限制性NKT，又称NKT样细胞(NKT
‑
like cells)可表达不同种类的TCR和NK标志，其来源及功能尚不清楚。
[0003]恒定自然杀伤T(invariant natural killer T，iNKT)细胞是具有限制性T细胞抗原受体(TCR)谱的T淋巴细胞的子集，也是识别CD1d分子呈递的糖脂类抗原；在接受抗原刺激之后，iNKT细胞快速反应，可分泌大量炎症细胞因子，包括干扰素
‑
γ(IFN
‑
γ)和白细胞介素
‑
4(IL
‑
4)，这种早期反应影响下游免疫反应的结果，所以iNKT细胞具有调节特性；由于其效应物功能的多样性，iNKT细胞参与许多病理过程，在宿主防御感染、预防自身免疫性疾病和防止癌症方面发挥重要作用。
[0004]目前，iNKT细胞在体外扩增培养扩增得到的iNKT细胞生物活性较低、难以成功的主要影响因素是：1、受供者年龄、身体条件等个体差异因素影响，iNKT细胞样品的特性与体外扩增培养方法契合度不高；2、自体血来源的iNKT细胞体外培养时，添加的细胞因子种类繁多；3、异基因临床应用困难；4、是否化疗。
[0005]现有技术中，文献《不同培养体系及不同培养时间制备的NKT细胞对A549细胞株的杀伤研究》(高紫玉，内蒙古医科大学硕士研究生学位论文(2021))提供了以GT
‑
T551基础培养基+IL
‑
2(500U/mL)+IL
‑
15(5ng/mL)和GT
‑
T551基础培养基+IL
‑
2(500U/mL)+IL
‑
15(5ng/mL)+CD3(50ng/mL)的培养体系，然而采用该培养体系的培养扩增的iNKT细胞杀伤实验显示无显著性差异，表明CD3抗体在增强细胞毒性作用方面效果不明显。
[0006]鉴于此，有必要提供一种新的脐血脐血iNKT细胞体外培养扩增和诱导活化的方法，以解决上述不足。

技术实现思路

[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种脐血iNKT细胞体外培养扩增和诱导活化的方法及应用。本专利技术采用两种类型的培养基，分别进行培养扩增和诱导活化，培养扩增阶
段采用了IL
‑
2、IL
‑
15和KDM2B因子，极大的提高了iNKT细胞的扩增效率，后期采用ConA和a
‑
GalCer双重激活调控因子，联合诱导iNKT细胞增值活化，提高了iNKT细胞的生物活性，获得的iNKT细胞具有较佳的抗肿瘤作用，且所获得的细胞数量充足。
[0008]本专利技术的目的之一是提供一种脐血iNKT细胞体外扩增和诱导活化的方法。
[0009]本专利技术的另一目的是提供一种包含前述方法得到的iNKT细胞的药物制剂。
[0010]本专利技术还提供了一种根据前述方法得到的iNKT细胞在制备抑制和治疗肺癌疾病药物中的应用。
[0011]根据本专利技术具体实施方式提供的脐血iNKT细胞体外扩增和诱导活化的方法，包括以下步骤：
[0012]扩增阶段：从脐血中分离、重悬获得含有iNKT细胞的脐血浆重悬细胞沉淀；细胞培养瓶中，按细胞密度≥3.0
×
106cells/mL，加入1640基础培养基、IL
‑
2、IL
‑
15、KDM2B和10vol％的所述脐血浆重悬细胞沉淀，扩增iNKT细胞；
[0013]诱导活化阶段：扩增iNKT细胞完成后，加入X
‑
VIV0 10培养基、ConA和a
‑
GalCer，诱导iNKT细胞活化成熟。
[0014]根据本专利技术具体实施方式提供的脐血iNKT细胞体外培养扩增和诱导活化的方法，所述脐血浆重悬细胞沉淀的制备包括以下步骤：
[0015]提供脐血，1800rpm离心10min，分离，取下层脐血细胞液；
[0016]所述下层脐血细胞液中加入生理盐水稀释，得到稀释液；
[0017]取淋巴细胞分离液于离心管中待用；
[0018]吸取所述稀释液，加入离心管中，使所述稀释液重叠于所述淋巴细胞分离液上并形成界面；
[0019]将所述离心管在3000rpm离心15min，分离得到PBMC液；
[0020]向所述PBMC液中加入生理盐水进行重悬，在1800rpm离心5min，弃去上清，制备得到脐血浆重悬细胞沉淀。
[0021]根据本专利技术具体实施方式提供的脐血iNKT细胞体外培养扩增和诱导活化的方法，所述扩增iNKT细胞的条件为：37℃；CO2浓度5％；时间12
‑
16d。
[0022]根据本专利技术具体实施方式提供的脐血iNKT细胞体外培养扩增和诱导活化的方法，所述扩增iNKT细胞过程中，每隔2
‑
3d向所述细胞培养瓶中补充1640基础培养基、IL
‑
2、IL
‑
15、KDM2B和5vol％的AB血浆。
[0023]根据本专利技术具体实施方式提供的脐血iNKT细胞体外培养扩增和诱导活化的方法，所述AB血浆分离自所述脐血，步骤包括：
[0024]提供脐血，1800rpm离心10min，分离，取上层血浆；
[0025]将所述上层血浆在56℃灭活30min，并在
‑
20℃冷却15min，2500rpm离心20min，收集得到的上清液即为AB血浆。
[0026]根据本专利技术具体实施方式提供的脐血iNKT细胞体外培养扩增和诱导活化的方法，所述扩增iNKT细胞过程中，IL...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脐血iNKT细胞体外扩增和诱导活化的方法，其特征在于，包括以下步骤：扩增阶段：从脐血中分离、重悬获得含有iNKT细胞的脐血浆重悬细胞沉淀；细胞培养瓶中，按细胞密度≥3.0
×
106cells/mL，加入1640基础培养基、IL
‑
2、IL
‑
15、KDM2B和10vol％的所述脐血浆重悬细胞沉淀，扩增iNKT细胞；诱导活化阶段：扩增iNKT细胞完成后，加入X
‑
VIV0 10培养基、ConA和a
‑
GalCer，诱导iNKT细胞活化成熟。2.根据权利要求1所述的脐血iNKT细胞体外扩增和诱导活化的方法，其特征在于，所述脐血浆重悬细胞沉淀的制备包括以下步骤：提供脐血，1800rpm离心10min，分离，取下层脐血细胞液；所述下层脐血细胞液中加入生理盐水稀释，得到稀释液；取淋巴细胞分离液于离心管中待用；吸取所述稀释液，加入离心管中，使所述稀释液重叠于所述淋巴细胞分离液上并形成界面；将所述离心管在3000rpm离心15min，分离得到PBMC液；向所述PBMC液中加入生理盐水进行重悬，在1800rpm离心5min，弃去上清，制备得到脐血浆重悬细胞沉淀。3.根据权利要求1所述的脐血iNKT细胞体外扩增和诱导活化的方法，其特征在于，所述扩增iNKT细胞的条件为：37℃；CO2浓度5％；时间12
‑
16d。4.根据权利要求1所述的脐血iNKT细胞体外扩增和诱导活化的方法，其特征在于，所述扩增iNKT细胞过程中，每隔2
‑
3d向所...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢佳琦，卢瑞珊，高大，
申请(专利权)人：广州正源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：