一种玻璃样冻存液及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种玻璃样冻存液及其应用，属于组织冻存技术领域

【技术实现步骤摘要】
一种玻璃样冻存液及其应用


[0001]本专利技术涉及组织冻存
，尤其涉及一种玻璃样冻存液及其应用
。

技术介绍

[0002]玻璃化冷冻是一种快速的冷冻方法，玻璃化冷冻用高浓度的冷冻保护剂置换细胞中的水，通过快速降温方式，使细胞内外的液态直接转化为粘稠的非晶体玻璃化态，从而最大限度地降低了细胞内外冰晶的形成
。
它通过使细胞内外液态直接转化为非晶体的玻璃化态，以减少细胞内外冰晶的形成
。
玻璃化冷冻不需要特殊的设备，节省了时间和成本
。
[0003]现有技术中，细胞冻存时向培养基中加入保护剂
‑
终浓度
5%~15%
的甘油或二甲基亚砜
(DMSO)
，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤
。
采用
"
慢冻快融
"
的方法能较好地保证细胞存活
。
根据渗透性的不同，冻存液可分为渗透性冻存液和非渗透性冻存液两类
。
渗透性冻存液能穿透细胞膜，可以结合溶液中的水分子而弱化冰晶的形成；非渗透性冻存液不能穿透细胞膜，但可提高细胞外渗透压，使细胞内水分子渗出细胞外而降低胞内冰晶的形成
。
由于渗透性冻存液对细胞有毒性，非渗透性冻存液会导致细胞失水而皱缩，故二者的浓度
、
用量均不能太高，玻璃化法中常联合使用这两类冻存液
。
现有的冻存方案常采用
10%DMSO+90%FBS
的冻存方案去保存细胞，但是该冻存方案成本较高，不能避免引入动物来源的病毒，存在对保存细胞的病毒污染风险，同时对组织的冻存效果较差，不能满足组织冻存的要求
。
[0004]华通氏胶间充质干细胞
(Wharton's jelly
‑
derived mesenchymal stem cells
，
WJ
‑
MSCs)
是一种分离自脐带华通氏胶的间充质干细胞，其基因表达谱符合目前对
MSCs
的界定，也表达一定水平的
OCT
‑
4、SOX
‑2和
NANOG
等多能性基因，除了能分化为成骨
、
成脂
、
成软骨细胞外，还能分化成内胚层和外胚层衍生细胞
。
此外，
WJ
‑
MSCs
不表达
MHC
‑
II
，免疫原性很低，并在体内表现出免疫调节特性，这使得它们成为细胞疗法中同种异体和异种移植的良好替代物，具有广泛的临床应用前景
。
当脐带干细胞进行大规模培养时，通常都是建立起种子库，待种子库用完后，还需要进行新的脐带筛选
。
另外，脐带组织经过一次提取建立起来的种子库细胞数量有限，因此，直接提取直接制约脐带组织块细胞的临床应用
。
因此将脐带华通氏胶组织进行冻存能够解决脐带干细胞的应用问题
。
[0005]目前现有的冻存剂用于脐带华通氏胶冻存的过程中，无法有效避免组织中的干细胞在冻存过程中因冰晶形成而导致的细胞大量死亡或活性显著降低
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种玻璃样冻存液，能够解决脐带华通氏胶冻存的过程中干细胞活性降低的问题
。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种玻璃样冻存液，所述玻璃样冻存液中含有氮酮
、
纤维二糖和
α
‑
乳糖；
所述氮酮在玻璃样冻存液中的终体积浓度为
3~5%
；所述纤维二糖在玻璃样冻存液中的终浓度为
0.1~0.5mol/L
；所述
α
‑
乳糖在玻璃样冻存液中的终浓度为
0.1~0.5mol/L。
[0008]优选的，所述玻璃样冻存液中含有血清替代品；所述血清替代品的体积占玻璃样冻存液总体积的
10~30%。
[0009]优选的，所述玻璃样冻存液以平衡盐溶液为基础溶剂
。
[0010]优选的，所述平衡盐溶液为
Eargle's
缓冲液
、Hank's
缓冲液和磷酸盐缓冲液中的一种或几种
。
[0011]优选的，所述玻璃样冻存液中含有二甲基亚砜
。
[0012]优选的，所述二甲基亚砜在玻璃样冻存液中的终体积浓度为
3~5%。
[0013]本专利技术还提供了上述玻璃样冻存液在细胞或组织玻璃样冻存中的应用
。
[0014]优选的，所述组织为脐带华通氏胶组织
。
[0015]优选的，所述脐带华通氏胶组织与玻璃样冻存液的体积比为
1:3~8。
[0016]本专利技术的技术效果和优点：本专利技术提供的玻璃样冻存液中含有氮酮
、
纤维二糖和
α
‑
乳糖，通过组分复配能够使冻存组织在低温下得到良好的保存，使得组织能够在短时间内产生较低程度的脱水但不影响生理性质，更有利于保存
。
当组织中含有干细胞时，本专利技术提供的玻璃样冻存液能够有效避免组织中的干细胞在冻存过程中因冰晶形成而导致细胞大量死亡的问题，当组织复苏后，可快速提取其中的干细胞，不影响干细胞的活性，与新鲜组织相比不具有显著性差异
。
本专利技术的玻璃样冻存液能够大大的提高了对组织的渗透性，避免冰晶的形成，提供了适合组织内细胞保存的微环境，降低了对细胞的机械损伤，避免了保存后温度下降或上升而造成细胞的损伤死亡
。
具体实施方式
[0017]本专利技术提供了一种玻璃样冻存液，所述玻璃样冻存液中含有氮酮
、
纤维二糖和
α
‑
乳糖，所述氮酮在玻璃样冻存液中的终体积浓度为
3~5%
，优选为
3.5~4.5%
，所述纤维二糖在玻璃样冻存液中的终浓度为
0.1~0.5mol/L
，优选为
0.2~0.4mol/L
；所述
α
‑
乳糖在玻璃样冻存液中的终浓度为
0.1~0.5mol/L
，优选为
0.2~0.4mol/L
，在本专利技术中，所述玻璃样冻存液优选以平衡盐溶液为基础溶剂，所述平衡盐溶液优选为
Eargle's
缓冲液
、Hank's
缓冲液和磷酸盐缓冲液中的一种或几种，进一步优选为
Hank's
缓冲液，所述氮酮
、
纤维二糖和
α
‑
乳糖稀释在
Hank's
缓冲液中
。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种玻璃样冻存液，其特征在于，所述玻璃样冻存液中含有氮酮
、
纤维二糖和
α
‑
乳糖；所述氮酮在玻璃样冻存液中的终体积浓度为
3~5%
；所述纤维二糖在玻璃样冻存液中的终浓度为
0.1~0.5mol/L
；所述
α
‑
乳糖在玻璃样冻存液中的终浓度为
0.1~0.5mol/L。2.
根据权利要求1所述的玻璃样冻存液，其特征在于，所述玻璃样冻存液中含有血清替代品；所述血清替代品的体积占玻璃样冻存液总体积的
10~30%。3.
根据权利要求1所述的玻璃样冻存液，其特征在于，所述玻璃样冻存液以平衡盐溶液为基础溶剂
。4.
根据权利要求3所述的玻璃样冻...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢佳琦，卢瑞珊，
申请(专利权)人：广州正源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：