一种脐血DC细胞的培养方法技术

本发明专利技术提供了一种脐血DC细胞的培养方法，该方法首先采用羟乙基淀粉和淋巴分离液对脐血进行双提纯，然后添加层粘连蛋白母液对DC细胞进行提取纯化，随后依次使用1640培养基和581培养基，并结合IL

【技术实现步骤摘要】
一种脐血DC细胞的培养方法


[0001]本专利技术属于再生医学和生物学
，具体涉及一种脐血DC细胞的培养方法。

技术介绍

[0002]DC细胞（树突状细胞）是迄今为止功能最强大的抗原呈递细胞，因成熟时有许多树状或伪足样突起而得名。DC常被称为“天然佐剂”，已成为抗原传播的天然媒介，具有免疫应答和免疫耐受两种功能，对维持免疫平衡具有重要作用。
[0003]树突状细胞是机体内发现的具有最强专职抗原提呈细胞。因其在成熟过程中能伸出大量树突样突起而得名，人体树突状细胞起源于造血干细胞，外周血树突状细胞在数量上不足外周血单个核细胞的1%，它能摄取、加工处理抗原，并能将处理后的抗原递呈给T淋巴细胞。未成熟的树突状细胞具有较强的迁移能力及摄取、加工抗原能力，成熟的树突状细胞能有效激活初始型T淋巴细胞，并能启动、调控并维持免疫应答。在病理条件下，DC的生理功能受到严重影响。在肿瘤微环境中，存在各种作用于D的抑制性细胞因子，导致DC功能异常，进而使肿瘤细胞逃脱免疫系统的监视。随着对DC生物学知识及其免疫应答机制的深入研究，DC疫苗的发展越来越迅速。DC的递呈能力是其他抗原提呈细胞的100倍；只有DC细胞才能激活幼稚T细胞；DC细胞过继性免疫治疗是目前临床上肿瘤细胞免疫治疗的重要手段。由于外周血中DC细胞含量少(约占淋巴细胞的1%)，体外扩增高效的DC细胞则成为DC细胞治疗的关键问题之一。
[0004]许多体外研究均显示IL
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4、GM
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CSF、TNF
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a对促进DC细胞的成熟、活化、增殖及细胞毒活性有重要作用。但经过研究发现，使用上述细胞因子的不同组合在一定程度上可以扩增体外的DC细胞，但是外周血样品年龄、是否化疗等条件直接影响了DC细胞的体外扩增成功与否，说明了现有DC细胞培养体系的稳定性较差。
[0005]同时，DC细胞在体外扩增培养时受受供者年龄、身体条件等因素影响较大。此外，现有技术中，自体血来源的DC细胞在体外培养时，添加的细胞因子种类繁多，且细胞扩增效果较差甚至失败，且培养扩增出来的DC细胞生物活性较差。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种脐血DC细胞的培养方法，该方法首创性的使用羟乙基淀粉和淋巴分离液的双提纯方法，以及促进贴壁法，同时使用层粘连蛋白（Laminin）对DC细胞进行提取纯化，有效缩短贴壁培养时间，随后先后采用1640培养基和581培养基，在1640培养基中添加IL
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4、GM
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CSF、TNF
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a、SCF以及AB血浆，在581培养基中结合脂多糖（LPS）和蛋白酶抑制剂对细胞进行刺激增殖、诱导成熟，使获得的DC细胞数量充足且活性高，表达率高、抗原递呈能力优异，从而完成本专利技术。
[0007]本专利技术在于提供一种脐血DC细胞的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：步骤1、取脐血，向脐血中添加羟乙基淀粉混匀，沉降分层后吸出上层液体，然后向上层液体添加生理盐水混匀、离心，弃上清液，再向沉淀中添加生理盐水，混匀，得到稀释后
的血液；步骤2、将步骤1得到的稀释后的血液加入淋巴细胞液中，离心后将含有PBMC（外周血中具有单个核的细胞）层液体吸出，然后向PBMC层液体中添加生理盐水后重悬、离心，得到重悬离心后的PBMC层液体；步骤3、取层粘蛋白母液进行稀释，形成工作液，将工作液与重悬离心后的PBMC层液体置于培养瓶中进行表面处理，离心后弃去上清液，向其中加入无血清1640基础培养基，重悬细胞沉淀，接种于培养瓶中后置于培养箱中孵育；步骤4、孵育后，将培养瓶中的悬浮细胞移除，向仅含有贴壁细胞的培养瓶中添加1640培养基、IL
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4、GM
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CSF、AB血浆进行培养；步骤5、培养6天后，弃上清液，添加581基础培养基、AB血浆，诱导DC细胞成熟培养。
附图说明
[0008]图1示出实施例1中对DC细胞培养第1天，第5天，第7天于倒置显微镜下的形态照片。
具体实施方式
[0009]下面将对本专利技术进行详细说明，本专利技术的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。
[0010]本专利技术在于提供一种脐血DC细胞的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：步骤1、取脐血，向脐血中添加羟乙基淀粉混匀，沉降分层后吸出上层液体，然后向上层液体添加生理盐水混匀、离心，弃上清液，再向沉淀中添加生理盐水，混匀，得到稀释后的血液；步骤2、将步骤1得到的稀释后的血液加入淋巴细胞液中，离心后将含有PBMC层（外周血中具有单个核的细胞）液体吸出，然后向PBMC层液体中添加生理盐水后重悬、离心，得到重悬离心后的PBMC层液体；步骤3、取层粘蛋白母液进行稀释，形成工作液，将工作液与重悬离心后的PBMC层液体置于培养瓶中进行表面处理，离心后弃去上清液，向其中加入无血清1640基础培养基，重悬细胞沉淀，接种于培养瓶中后置于培养箱中孵育；步骤4、孵育后，将培养瓶中的悬浮细胞移除，向仅含有贴壁细胞的培养瓶中添加1640培养基、IL
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4、GM
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CSF、AB血浆进行培养；步骤5、培养6天后，弃上清液，添加581基础培养基、AB血浆，诱导DC细胞成熟培养。
[0011]以下对该步骤进行具体描述和说明。
[0012]步骤1、取脐血，向脐血中添加羟乙基淀粉混匀，沉降分层后吸出上层液体，然后向上层液体添加生理盐水混匀、离心，弃上清液，再向沉淀中添加生理盐水，混匀，得到稀释后的血液。
[0013]脐血与羟乙基淀粉经混匀后，自然沉降，脐血与羟乙基淀粉的质量比优选为1:1，沉降时间优选20～45min，待上下液面分层，上下液面体积比为1:1。
[0014]将析出的上层液体转移至离心管中，方便后续混匀和离心。
[0015]第一次添加的生理盐水和上层液体的体积比为（0.8～1.5）：1，优选为1:1。
[0016]所述离心转速为1500～2500rpm，优选1700～2000rpm。所述离心时间为5～15min，优选8～12min。
[0017]第二次添加的生理盐水与沉淀的体积比为（0.9～1.2）：1，优选1:1。
[0018]步骤2、将步骤1得到的稀释后的血液加入淋巴细胞液中，离心后将含有PBMC层液体吸出，然后向PBMC层液体中添加生理盐水后重悬、离心，得到重悬离心后的PBMC层液体。
[0019]所述稀释后的血液与淋巴细胞液的体积比为（0.8～1.2）：1，优选1:1。
[0020]优选采用一次性移液管或巴氏吸管将稀释后的血液缓慢加入淋巴细胞液中，避免破坏已形成的界面，使稀释后的血液和淋巴细胞液二者之间形成清晰的界面。
[0021]第一次离心优选在离心机中进行，离心转速为2500～3500rpm，优选3000rpm。
[0022]离心时间为10～20min，优选15min。
[0023]第二次离心转速为1500～20本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脐血DC细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：步骤1、取脐血，向脐血中添加羟乙基淀粉混匀，沉降分层后吸出上层液体，然后向上层液体添加生理盐水混匀、离心，弃上清液，再向沉淀中添加生理盐水，混匀，得到稀释后的血液；步骤2、将步骤1得到的稀释后的血液加入淋巴细胞液中，离心后将含有PBMC层液体吸出，然后向PBMC层液体中添加生理盐水后重悬、离心，得到重悬离心后的PBMC层液体；步骤3、取层粘蛋白母液进行稀释，形成工作液，将工作液与重悬离心后的PBMC层液体置于培养瓶中进行表面处理，离心后弃去上清液，向其中加入无血清1640基础培养基，重悬细胞沉淀，接种于培养瓶中后置于培养箱中孵育；步骤4、孵育后，将培养瓶中的悬浮细胞移除，向仅含有贴壁细胞的培养瓶中添加1640培养基、IL
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4、GM
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CSF、AB血浆进行培养；步骤5、培养6天后，弃上清液，添加581基础培养基、AB血浆，诱导DC细胞成熟培养。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤1中，第一次添加的生理盐水和上层液体的体积比为（0.8～1.5）：1；第二次添加的生理盐水与沉淀的体积比为（0.9～1.2）：1。3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤2中，所述稀释后的血液与淋巴细胞液的体积比为（0.8～1.2）：1。4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤3中，稀释倍数为5000～15000倍，...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢佳琦，卢瑞珊，高大，
申请(专利权)人：广州正源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：