一种诱导生成巨核细胞的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种诱导生成巨核细胞的方法及其应用，属于细胞诱导分化技术领域。本发明专利技术以胎盘组织为原料，分离得到包含胎盘造血干细胞的有核细胞，然后对有核细胞进行扩增、传代，最后通过特定的诱导培养基诱导，最终成功得到巨核细胞。通过本发明专利技术提供的方法解决了现有技术中体外诱导分化所得巨核细胞生产性能较差、不能满足血小板需求的问题。通过本发明专利技术诱导生成的巨核细胞生产性能优异，能够生成大量血小板，为血小板成分血制品的规模化生产提供了一种有效途径。供了一种有效途径。

【技术实现步骤摘要】
一种诱导生成巨核细胞的方法及其应用
[0001]本专利技术要求申请号为202310670739.2，申请日为2023年06月08日，专利技术名称为“一种体外生产血小板的方法”的中国专利的优先权。


[0002]本专利技术涉及细胞诱导分化
，尤其涉及一种诱导生成巨核细胞的方法及其应用。

技术介绍

[0003]巨核细胞(Megakaryocyte)是骨髓中的一种从造血干细胞分化而来的细胞，是正常骨髓中的一种能生成血小板的成熟细胞，前身为颗粒巨核细胞。该细胞体积巨大，成熟的巨核细胞边缘部分破裂脱落后形成血小板。每个巨核细胞能生成200～7700个血小板。巨核细胞的核虽然很大，但其在骨髓中数量非常少，研究起来非常困难。
[0004]血小板是哺乳动物血液中的重要有形成分之一，它在止血、凝血以及免疫炎症的发生发展中发挥了重要的作用。血小板减少或者功能障碍会引起机体不同度的出血，严重时甚至可导致患者死亡。对血小板减少或者功能碍的患者临床上目前多采用输注血小板的方法进行治疗；然而，随着血小板输注总人数的逐年递增，仅仅靠无偿献血获得的血小板并不能满足临床的需求，同时由无偿献血获得的血小板还受到储存时间短和易受病原污染等方面的限制，因此需要更安全、可信赖的血小板来源和更便利的血小板生产方法。
[0005]现有技术中存在一些诱导得到巨核细胞，进而生产血小板的方案，包括采用外周血造血干细胞、骨髓造血干细胞、脐带血造血干细胞和胚胎干细胞等，例如Lu等用人胎胞(human embryonic stem cell，hESC)来源的成血管细胞(heman
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gioblasts/blast cells，BCs)作为生成巨核细胞的中间细胞，诱导其生成巨核细胞进而生成血小板。该研究小组还探讨了适合BCs细胞诱导分化为巨核细胞的培养体系，采用由Stem
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line1、50ng/mL TPO、20ng/mL干细胞因子(stem cellfactor，SCF)、20ng/mL IL
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11组成的TSI培养基培养条件下培养4～6d得到的人胎干胞巨核细胞(human ESC megakaryocytes，hESC
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MK)，加到由OP9鼠基质细胞、a
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MEM、150mL/L胎牛血清(FBS)、50ng/mL SCF、100ng/mL TPO、25/mL肝素钠组成的体系中，继续培养4
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8d，通过流式细胞仪检测CD41/CD42b的表达情况，结果发现该培养体系有利于hESC
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MK生成血小板，并验证了hESC
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来源的血小板也同样具有正常人血液中血小板相似的特性。
[0006]但是，现有的研究虽然能够获得巨核细胞和血小板，但是诱导获得的巨核细胞性能较差，分化产生的血小板的数量仍低于体内，并不能实现血小板规模化生产。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种诱导生成巨核细胞的方法，通过本专利技术诱导生成的巨核细胞生产性能优异，能够生成大量血小板；本专利技术提供的体外生产血小板的方法能够用于高效生产血小板，生产更为便利。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了一种诱导生成巨核细胞的方法，包括以下步骤：
[0010]将胎盘组织进行预处理，得到组织碎块；
[0011]将组织碎块进行多次消化过滤，合并滤液后终止消化，得到细胞混合物；
[0012]将细胞混合物分散为细胞悬液；
[0013]将细胞悬液加至淋巴细胞分离液上层，进行离心，离心后的体系表现出培养基层和淋巴细胞分离液层，有核细胞位于培养基层和淋巴细胞分离液层交界面上；
[0014]收集有核细胞，依次进行扩增培养和传代，得到子代细胞；
[0015]将子代细胞接种至诱导培养基，诱导培养12～36h后得到巨核细胞；
[0016]所述诱导培养基中包括以下终浓度的组分：
[0017]40～60μg/mL的艾曲泊帕和50～100μg/mL的干细胞因子。
[0018]优选的，所述诱导培养基采用α
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MEM培养基和/或581培养基作为基础培养基。
[0019]优选的，所述胎盘组织在预处理之前采用胎盘保存液进行保存，和/或，所述胎盘组织在预处理之前采用3～5℃条件保存；
[0020]所述胎盘保存液以生理盐水为溶剂，所述胎盘保存液包括以下终浓度的组分：
[0021]3～8％白蛋白和0.5～1.5％青
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链霉素；
[0022]所述保存的时间在36h之内；
[0023]所述消化采用消化液进行，所述消化液以581培养基为溶剂，包括以下终浓度的组分：
[0024]0.03～0.08％胰蛋白酶替代物和0.05～0.15g/mL中性蛋白酶；
[0025]所述组织碎块和消化液的质量体积比为1g:8～12mL；
[0026]每次消化的时间为8～12min；
[0027]所述过滤的目数为80～120目。
[0028]优选的，所述预处理包括以下步骤：
[0029]去除胎盘组织中的大血管和结缔组织，用PBS缓冲液洗涤至胶白色，然后去除胎盘组织中的小血管和纤维连接成分，将组织剪碎，得到1～3mm3组织碎块；
[0030]所述终止消化包括将滤液与血清替代品混合，所述滤液和血清替代品的体积百分比为2～5％。
[0031]优选的，所述将细胞混合物分散为细胞悬液包括：将细胞混合物依次第一次离心、去除红细胞、第二次离心、洗涤、第三次离心和重悬细胞，得到细胞悬液；
[0032]所述第一次离心、第二次离心和第三次离心的温度独立的为3～5℃，所述第一次离心、第二次离心和第三次离心的转速独立的为800～1200g，所述第一次离心、第二次离心和第三次离心的时间独立的为3～8min；
[0033]所述第一次离心、第二次离心和第三次离心结束后分别收集沉淀，得到第一沉淀、第二沉淀和第三沉淀；
[0034]所述去除红细胞包括将第一沉淀和红细胞裂解液混合；
[0035]所述去除红细胞的过程中伴随冰浴；
[0036]所述去除红细胞的时间为20～40min；
[0037]所述洗涤包括采用PBS缓冲液对第二沉淀洗涤2～5次；
[0038]所述重悬细胞包括采用581培养基与第三沉淀混合，得到细胞悬液。
[0039]优选的，所述细胞悬液和淋巴细胞分离液的体积比为1:0.8～1.2；
[0040]所述离心的温度为3～5℃，所述离心的转速为300～700g，所述离心的时间为15～25min。
[0041]优选的，所述扩增培养采用扩增培养基，所述扩增培养基中包括以下组分：
[0042]血清替代品、谷氨酰胺溶液和NEAA非必需氨基酸溶液；
[0043]所述血清替代品占扩增培养基总体积的3～8％；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导生成巨核细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将胎盘组织进行预处理，得到组织碎块；将组织碎块进行多次消化过滤，合并滤液后终止消化，得到细胞混合物；将细胞混合物分散为细胞悬液；将细胞悬液加至淋巴细胞分离液上层，进行离心，离心后的体系表现出培养基层和淋巴细胞分离液层，有核细胞位于培养基层和淋巴细胞分离液层交界面上；收集有核细胞，依次进行扩增培养和传代，得到子代细胞；将子代细胞接种至诱导培养基，诱导培养12～36h后得到巨核细胞；所述诱导培养基中包括以下终浓度的组分：40～60μg/mL的艾曲泊帕和50～100μg/mL的干细胞因子。2.根据权利要求1所述的诱导生成巨核细胞的方法，其特征在于，所述诱导培养基采用α
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MEM培养基和/或581培养基作为基础培养基。3.根据权利要求1所述的诱导生成巨核细胞的方法，其特征在于，所述胎盘组织在预处理之前采用胎盘保存液进行保存，和/或，所述胎盘组织在预处理之前采用3～5℃条件保存；所述胎盘保存液以生理盐水为溶剂，所述胎盘保存液包括以下终浓度的组分：3～8％白蛋白和0.5～1.5％青
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链霉素；所述保存的时间在36h之内；所述消化采用消化液进行，所述消化液以581培养基为溶剂，包括以下终浓度的组分：0.03～0.08％胰蛋白酶替代物和0.05～0.15g/mL中性蛋白酶；所述组织碎块和消化液的质量体积比为1g:8～12mL；每次消化的时间为8～12min；所述过滤的目数为80～120目。4.根据权利要求1所述的诱导生成巨核细胞的方法，其特征在于，所述预处理包括以下步骤：去除胎盘组织中的大血管和结缔组织，用PBS缓冲液洗涤至胶白色，然后去除胎盘组织中的小血管和纤维连接成分，将组织剪碎，得到1～3mm3组织碎块；所述终止消化包括将滤液与血清替代品混合，所述滤液和血清替代品的体积百分比为2～5％。5.根据权利要求1所述的诱导生成巨核细胞的方法，其特征在于，所述将细胞混合物分散为细胞悬液包括：将细胞混合物依次第一次离心、去除红细胞、第二次离心、洗涤、第三次离心和重悬细胞，得到细胞悬液；所述第一次离心、第二次离心和第三次离心的温度独立的为3～5℃，所述第一次离心、第二次离心和第三次离心的转速独立的为800～1200g，所述第一次离心、第二次离心和第三次离心的时间独立的为3～8min；所述第一次离心、第二次离心和第三次离心结束后分别收集沉淀，得到第一沉淀、第二沉淀和第三沉淀；所述去除红细胞包括将第一沉淀和红细胞裂解液混合；所述去除红细胞的过程中伴随冰浴；
所述去除红细胞的时间为20～40min；所述洗涤包括采用PBS缓冲液对第二沉淀洗涤2～5次；所述重悬细胞包括采用581培养基与第三沉淀混合，得到细胞悬液。6.根据权利要求1所述的诱导生成巨核细胞的方法，其特征在于，所述细胞悬液和淋巴细胞分离液的体积比为1:0.8～1.2；所述离心的温度为3～5℃，所述离心的转速为300～700g，所述离心的时间为15～25min。7.根据权利要求1所述的诱导生成巨核细胞的方法，其特征在于，所述扩增培养采用扩增培养基，所述扩增培养基中包括以下组分：血清替代品、谷氨酰胺溶液和NEAA非必需氨基酸溶液；所述血清替代品占扩增培养基总体积的3～8％；所述谷氨酰胺溶液占扩增培养基总体积的0.5～1.5％；所述NEAA非必需氨基酸溶液占扩增培养基总体积的0.5～1.5％；所述扩增培养基采用α
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MEM培养基和/或581培养基作为基础培养基。8.根据权利要求1所述的诱导生成巨核细胞的方法，其特征在于，所述子代细胞为第二代细胞。9.一种体外生产血小板的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用权利要求1～8任一项所述的方法诱导生成巨核细胞，将得到的巨核细胞与复...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢佳琦，卢瑞珊，
申请(专利权)人：广州正源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：