本发明专利技术公开了一种体外扩增培养记忆性免疫细胞的方法，包括：利用淋巴细胞分离液对从外周血或单采血中分离免疫细胞；在完全培养基中，用第一溶液对步骤1)得到的免疫细胞进行激活；免疫细胞活化后，培养期间，补加第二溶液，每隔一段时间调整细胞培养密度；采用不同培养容器，比较细胞扩增倍数和表型以确定最优培养容器，并得到记忆性免疫细胞。本发明专利技术在传统免疫细胞培养基的基础上，优化了培养体系(细胞因子种类及浓度、细胞培养密度及培养容器)可以作为记忆性免疫细胞的制备方法应用于生产，提高特异性T细胞的比例和数量。提高特异性T细胞的比例和数量。提高特异性T细胞的比例和数量。
【技术实现步骤摘要】
一种体外扩增培养记忆性免疫细胞的方法
[0001]本专利技术属于生物
，涉及免疫细胞，尤其涉及一种体外扩增培养记忆性免疫细胞的方法。
技术介绍
[0002]过继性免疫细胞疗法，包括肿瘤靶向性T细胞的体外扩增和回输，如肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和具有常规T细胞受体的基因重组的T细胞(TCRs)或嵌合抗原受体(CARs)正逐渐成为晚期癌症患者的二线治疗方法。然而，肿瘤细胞的代谢活性失调导致免疫抑制肿瘤微环境(TME)，包括由肿瘤或基质细胞分泌的可溶性因子，以及抑制性免疫细胞如髓源性抑制细胞(MDSCs)和调节性T细胞(Tregs)，导致免疫细胞疗法代谢应激和衰竭。
[0003]目前的过继性免疫细胞疗法，大多聚焦于肿瘤细胞的靶向性，采用基因编辑的方式导入一段抗体序列，忽略了T细胞本身的功能性，获得的T细胞绝大多数为终末分化的T细胞(Teff)，在体内难以长期存活。
技术实现思路
[0004]为了解决免疫细胞在体外培养过程中容易分化成终末效应T细胞的问题，本专利技术建立了一种体外扩增培养记忆性免疫细胞的方法，是用外周血或者单采血作为细胞来源，从中分离得到淋巴细胞后，再进一步在免疫细胞完全培养基中诱导、扩增、培养记忆性T细胞。总的培养时间为12天，期间根据细胞密度不断补加新鲜的完全培养基，调整培养密度。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种体外扩增培养记忆性免疫细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
[0007]1)利用淋巴细胞分离液对从外周血或单采血中分离免疫细胞；
[0008]2)在完全培养基中，用第一溶液对步骤1)得到的免疫细胞进行激活；
[0009]3)免疫细胞活化后，培养期间，补加第二溶液，每隔一段时间调整细胞培养密度；
[0010]4)采用不同培养容器，比较细胞扩增倍数和表型以确定最优培养容器，并得到记忆性免疫细胞。
[0011]作为本专利技术的一种优选方案，步骤2)中，第一溶液包括以下组分：免疫细胞培养基，IL
‑
2：20～100IU/mL，IL
‑
21：10～50ng/mL，IL
‑
7：30～120IU/mL与激活磁珠。
[0012]作为本专利技术的一种优选方案，免疫细胞培养基为ImmunoCult
‑
XF、TexMACS或X
‑
VIVO中的一种。
[0013]作为本专利技术的一种优选方案，步骤3)中，第二溶液包括以下组分：免疫细胞培养基，IL
‑
2：50～300IU/mL，IL
‑
21：20～100ng/mL，IL
‑
7：50～200IU/mL与血清替代物。
[0014]作为本专利技术的一种优选方案，免疫细胞培养基为ImmunoCult
‑
XF、TexMACS或X
‑
VIVO中的一种。
[0015]作为本专利技术的一种优选方案，记步骤2)中的第一溶液对免疫细胞激活为D0天，调
整细胞密度为1～4E6/mL。
[0016]作为本专利技术的一种优选方案，步骤3)的培养时间共为D12天，在D2加入2
‑
3倍体积的第二溶液，在D4调整细胞密度为5E5/mL；在D6调整细胞密度为6E5/mL；在D8调整细胞密度为7E5/mL；在D10调整细胞密度为8E5/mL。
[0017]作为本专利技术的一种优选方案，步骤4)中，培养容器包括G
‑
Rex培养容器，Origen培养袋，Takara培养袋与传统培养瓶。
[0018]作为本专利技术的一种优选方案，步骤1)具体为：取50mL离心管，加入与血液样本等体积的分离液；用移液管缓慢将血液样本加于分离液之上，500～1000g，离心20～30min；离心后，吸取第二层环状乳白色淋巴细胞至新的离心管中，加入10mL PBS，混匀细胞；250g，离心10min，弃上清，得到免疫细胞。
[0019]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0020]1)本专利技术在传统免疫细胞培养基的基础上，优化了培养体系(细胞因子种类及浓度、细胞培养密度及培养容器)可以作为记忆性免疫细胞的制备方法应用于生产，提高特异性T细胞的比例和数量。
[0021]2)本专利技术用外周血或者单采血作为细胞来源，从中分离得到淋巴细胞后，再进一步在免疫细胞完全培养基中诱导、扩增、培养记忆性T细胞。
附图说明
[0022]图1是不同组别细胞扩增倍数示意图。
[0023]图2是不同组别细胞活率示意图。
[0024]图3是不同组别细胞表型示意图。
具体实施方式
[0025]为了使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术，但下述实施例仅仅为本专利技术的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本专利技术的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026]本专利技术提供了一种体外扩增培养记忆性免疫细胞的方法，是用外周血或者单采血作为细胞来源，从中分离得到淋巴细胞后，再进一步在免疫细胞完全培养基中诱导、扩增、培养记忆性T细胞。总的培养时间为12天，期间根据细胞密度不断补加新鲜的完全培养基，调整培养密度。
[0027]实施例1
[0028]本实施例公开的体外扩增培养记忆性免疫细胞的方法，包括以下步骤：
[0029]一、利用淋巴细胞分离液从外周血或单采血中分离免疫细胞：
[0030](1)所采用的淋巴细胞分离液为GE公司的GE Ficoll
‑
Paque(货号：17
‑
1440
‑
02)。
[0031](2)取50mL离心管，加入与血液样本等体积的分离液。
[0032](3)用移液管缓慢将血液样本加于分离液之上，500～1000g，离心20～30min。
[0033](4)离心后，吸取第二层环状乳白色淋巴细胞至新的离心管中，加入10mL PBS，混
匀细胞。
[0034](5)250g，离心10min，弃上清。
[0035]二、用激活磁珠对免疫细胞进行激活：
[0036]1)用第一溶液重悬细胞，调整细胞密度为1～4E6/mL，温度是37，℃5％ CO2。
[0037]2)第一溶液成份：免疫细胞培养基为ImmunoCult
‑
XF或TexMACS或X
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VIVO(三种免疫细胞培养基均可，本实施例中采用ImmunoCult
‑
X)，IL
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2：20～100IU/mL，IL
‑
21：10～50ng/mL本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种体外扩增培养记忆性免疫细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)利用淋巴细胞分离液对从外周血或单采血中分离免疫细胞；2)在完全培养基中，用第一溶液对步骤1)得到的免疫细胞进行激活；3)免疫细胞活化后，培养期间，补加第二溶液，每隔一段时间调整细胞培养密度；4)采用不同培养容器，比较细胞扩增倍数和表型以确定最优培养容器，并得到记忆性免疫细胞。2.根据权利要求1所述的一种体外扩增培养记忆性免疫细胞的方法，其特征在于，步骤2)中，第一溶液包括以下组分：免疫细胞培养基，IL
‑
2：20～100IU/mL，IL
‑
21：10～50ng/mL，IL
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7：30～120IU/mL与激活磁珠。3.根据权利要求2所述的一种体外扩增培养记忆性免疫细胞的方法，其特征在于，免疫细胞培养基为ImmunoCult
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XF、TexMACS或X
‑
VIVO中的一种。4.根据权利要求1所述的一种体外扩增培养记忆性免疫细胞的方法，其特征在于，步骤3)中，第二溶液包括以下组分：免疫细胞培养基，IL
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2：50～300IU/mL，IL
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21：20～100ng/mL，IL
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7：50～200IU/mL与血清替代物。5.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈相波，应荣，田朋飞，雷鸣，
申请(专利权)人：上海奈康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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