一种人羊膜上皮细胞的分离方法技术

本发明专利技术提供了一种人羊膜上皮细胞的分离方法，属于细胞分离技术领域

【技术实现步骤摘要】
一种人羊膜上皮细胞的分离方法


[0001]本专利技术涉及细胞分离
，尤其涉及一种人羊膜上皮细胞的分离方法
。

技术介绍

[0002]人羊膜（
amnioticmembrane
，
AM
）是胎盘最接近胎儿的一层，它是由上皮和以结缔组织为主要成分的基质层组成的无血管膜，该层在怀孕期间包裹着胎儿和羊水，使发育中的胚胎免受来自周围环境的各种刺激作用
。
人羊膜上皮细胞
(human amniotic epithelial cells, hAECs)
源自最接近胎儿的胎盘最内层，由胚胎内细胞团分化发育而成
。hAECs
作为围产期干细胞的一种，兼具
ESCs
和成体干细胞的双重特性
(
多能性和免疫调节能力
)。
目前，
hAECs
已广泛用于多种疾病的临床前研究，包括中枢神经系统损伤与疾病
、
糖尿病
、
肝损伤
、
肺损伤
、
急性肾损伤
、
卵巢损伤
、
角膜损伤和肿瘤等，均体现出良好的治疗效果和安全性
。
[0003]现有技术中公开了某些制备人羊膜上皮细胞的方法，例如专利文件
CN110218695A
公开的人羊膜上皮细胞的提取制备方法，包括采集胎盘组织
、
提取人羊膜上皮细胞，先使用胰酶进行预消化，再进行正消化
>、
细胞的扩增，进行原代培养和传代扩增培养
、
细胞的冻存
、
细胞的复苏
。
但是此技术方案和其他现有的技术方案均具有以下缺点：
1.
由于胎盘羊膜质地致密，直接进行酶解消化的提取方式耗时长，虽然最终获取细胞数量多，但是细胞的活率较低；
2.
获取的细胞中含有大量的杂细胞，给后续纯化造成困难；
3.
整个人羊膜上皮细胞提取过程步骤繁琐
、
过程中污染几率较高，导致每次提取的细胞数量波动性较大，不利于工业化生产
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种人羊膜上皮细胞的分离方法，以解决现有技术中人羊膜上皮细胞获取方法耗时长
、
细胞活率低
、
纯度低等问题
。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种人羊膜上皮细胞的分离方法，包括以下步骤：将羊膜组织碎块与硬质颗粒混合，进行振荡处理，得到分解组织；将分解组织与消化试剂混合，进行消化处理，终止消化后得到消化液；将消化液依次进行稀释
、
离心后得到细胞沉淀；将细胞沉淀接种至培养基，实现人羊膜上皮细胞的分离；所述消化试剂中含有蛋白酶和胶原酶
。
[0006]优选的，所述羊膜组织碎块的粒径在
3mm2以下；和
/
或，所述硬质颗粒的粒径为
1~2mm。
[0007]优选的，所述硬质颗粒的形状为球体；和
/
或，所述硬质颗粒的材质为金属
、
玻璃
、
塑料或石质
。
[0008]优选的，所述羊膜组织碎块与硬质颗粒混合之前进行洗涤，所述洗涤采用的洗涤
剂为含有抗生素的
PBS
；和
/
或，所述抗生素在
PBS
中的终体积浓度为
0.8~1.2%
；和
/
或，所述抗生素为青链霉素
。
[0009]优选的，所述羊膜组织碎块与硬质颗粒的体积比为
1:0.8~1.2。
[0010]优选的，所述振荡处理的转速为
2000~3000 r/min
；和
/
或，所述振荡处理的时间为
1~5min。
[0011]优选的，所述分解组织与消化试剂的体积比为
1:2~3。
[0012]优选的，所述消化处理的温度为
35~38℃
；和
/
或，所述消化处理伴随振荡，所述振荡的转速为
200~300r/min
；和
/
或，所述消化处理的时间为
5~15min。
[0013]优选的，所述终止消化采用的终止剂为低糖
DMEM
培养基，所述低糖
DMEM
培养基中含有终体积浓度为
8~12%
的胎牛血清
。
[0014]优选的，所述离心的转速为
2000~3000 r/min
；和
/
或，所述离心的时间为
3~8min
；和
/
或，所述稀释采用的稀释剂为生理盐水
。
[0015]本专利技术的有益效果：本专利技术采用硬质颗粒与消化试剂相结合，利用硬质颗粒在震荡过程中产生的剪切力对质地致密的羊膜进行组织初步分解
、
再结合消化试剂进行消化处理，大大缩短了人羊膜上皮细胞的提取时间，提取的细胞污染几率低
、
数量充足
、
纯度和细胞活率较高；本专利技术的分离方法提取的细胞数量较稳定，利于产业应用
。
附图说明
[0016]图1为人羊膜上皮细胞观察结果；图2为人羊膜上皮细胞免疫荧光鉴定结果
。
具体实施方式
[0017]本专利技术提供了一种人羊膜上皮细胞的分离方法，包括以下步骤：将羊膜组织碎块与硬质颗粒混合，进行振荡处理，得到分解组织；将分解组织与消化试剂混合，进行消化处理，终止消化后得到消化液；将消化液依次进行稀释
、
离心后得到细胞沉淀；将细胞沉淀接种至培养基，实现人羊膜上皮细胞的分离
。
[0018]在本专利技术中，所述羊膜组织碎块优选通过以下步骤得到：将羊膜进行洗涤，洗涤后剪碎，得到羊膜组织碎块，所述洗涤的作用是去除干净羊膜组织中的血细胞，所述洗涤采用的洗涤剂优选为含有抗生素的
PBS
；所述抗生素在
PBS
中的终体积浓度优选为
0.8~1.2%
，进一步优选为
0.9~1.1%
；所述抗生素优选为青链霉素，所述羊膜组织碎块的粒径优选在
3mm2以下，进一步优选为
1~2mm2。
[0019]在本专利技术中，将羊膜组织碎块与硬质颗粒混合，进行振荡处理，得到分解组织，所述硬质颗粒的粒径优选为
1~2mm
，进一步优选为
1.3~1.7mm
；所述硬质颗粒的形状优选为球体；所述硬质颗粒的材质优选为金属
、
玻璃
、
塑料或石质；所述羊膜组织碎块与硬质颗粒的体积比优选为
1:0.8~1.2
；所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种人羊膜上皮细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：将羊膜组织碎块与硬质颗粒混合，进行振荡处理，得到分解组织；将分解组织与消化试剂混合，进行消化处理，终止消化后得到消化液；将消化液依次进行稀释
、
离心后得到细胞沉淀；将细胞沉淀接种至培养基，实现人羊膜上皮细胞的分离；所述消化试剂中含有蛋白酶和胶原酶
。2.
根据权利要求1所述的人羊膜上皮细胞的分离方法，其特征在于，所述羊膜组织碎块的粒径在
3mm2以下；和
/
或，所述硬质颗粒的粒径为
1~2mm。3.
根据权利要求2所述的人羊膜上皮细胞的分离方法，其特征在于，所述硬质颗粒的形状为球体；和
/
或，所述硬质颗粒的材质为金属
、
玻璃
、
塑料或石质
。4.
根据权利要求1所述的人羊膜上皮细胞的分离方法，其特征在于，所述羊膜组织碎块与硬质颗粒混合之前进行洗涤，所述洗涤采用的洗涤剂为含有抗生素的
PBS
；和
/
或，所述抗生素在
PBS
中的终体积浓度为
0.8~1.2%
；和
/
或，所述抗生素为青链霉素
。5.
根据权利要求2所述的人羊膜上皮细胞的分离方法，其特征在于，所述羊膜组织碎块与硬质颗粒的体积比为
1:0....

【专利技术属性】
技术研发人员：谢佳琦，卢瑞珊，
申请(专利权)人：广州正源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：