哺乳动物早期胚胎样细胞的诱导方法及其应用技术

本发明专利技术提供了哺乳动物早期胚胎样细胞的诱导方法及其应用，所述方法包括在激发磷酸化STAT3高表达的条件下培养胚胎干细胞(ESC)。STAT3高表达的条件下培养胚胎干细胞(ESC)。

【技术实现步骤摘要】
哺乳动物早期胚胎样细胞的诱导方法及其应用


[0001]本专利技术属于哺乳动物生殖领域，具体地涉及哺乳动物早期胚胎样细胞的体外培养。

技术介绍

[0002]哺乳动物体内早期胚胎发育是从合子到二细胞、四细胞、桑椹胚、着床前囊胚和着床后胚胎的过程，是细胞增殖和大规模表观遗传重塑同时发生的过程，这一过程直接决定了胚胎基因组激活和细胞命运的决定。而哺乳动物合子基因组激活(ZGA)是胚胎发生的关键步骤，发生在小鼠的1
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2细胞期和人类的4
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8细胞期，这一阶段对于哺乳动物早期胚胎发育和全能性的形成具有重要意义。
[0003]在小鼠胚胎干细胞中含有部分(小于1％)异质性细胞，即类似2
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细胞期胚胎样细胞(2C
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like细胞)。2C
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like细胞不仅可以表达zga转录本，而且具有与2细胞胚胎相似的表观遗传特征。此外，小鼠ESCs中的2C
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like细胞在体内发育状态下可同时发育为胚胎和胚外组织中。所以这部分2C
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like细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.早期胚胎样细胞的体外诱导方法，所述方法包括在激发磷酸化STAT3高表达的条件下培养胚胎干细胞(ESC)。2.根据权利要求1的方法，所述方法包括：利用添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基培养胚胎干细胞的步骤；和/或利用添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基培养胚胎干细胞的步骤。3.根据权利要求1的方法，所述方法还包括在利用添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基培养胚胎干细胞的步骤，以及利用添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基培养胚胎干细胞的步骤前，用添加MEK/ERK信号通路抑制剂，GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基培养胚胎干细胞的步骤。4.根据权利要求1的方法，所述方法还包括将胚胎干细胞解离的步骤，优选地，利用酶将胚胎干细胞解离，更优选地，所述酶为Accutase、分散酶或胰蛋白酶。5.根据权利要求1的方法，所述胚胎干细胞是从早期哺乳动物胚胎
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胚泡的内细胞团得到的。6.根据权利要求1的方法，所述胚胎干细胞包括分离的胚胎干细胞、原代胚胎干细胞或其群或细胞系建立的细胞系，或者，所述胚胎干细胞被遗传修饰。7.根据权利要求1的方法，所述胚胎干细胞是Gata6报告基因敲入的胚胎干细胞，优选地，所述胚胎干细胞是表达Gata6::Venus报告分子的胚胎干细胞；和/或所述胚胎干细胞是转染了GY118F基因的胚胎干细胞。8.根据权利要求1的方法，所述方法包括以下步骤：(1)用添加MEK/ERK信号通路抑制剂，GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基培养胚胎干细胞；(2)利用添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基培养胚胎干细胞；(3)利用添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基培养胚胎干细胞；以及(4)利用酶将胚胎干细胞解离，优选地，所述步骤(1)使用2iL培养基培养，每天换液，每三天传代，更优选地，培养条件为5％CO2，36
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38℃，优选37℃；优选地，所述步骤(2)包括解离步骤(1)获得的细胞，以及用CL培养基培养0.5
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1.5天，优选培养1天；优选地，所述步骤(3)包括用CLG培养基培养步骤(2)获得的细胞1.5
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3.5天，优选培养2天，优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在牛血清白蛋白或海藻糖中的GCSF，更优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在0.05％
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0.15％牛血清白蛋白或3％
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7％海藻糖中的GCSF，更优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子
GCSF的培养基中添加了溶解在0.1％牛血清白蛋白或5％海藻糖中的GCSF。9.根据权利要求2的方法，所述方法中添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基是在胚胎干细胞培养基中添加了GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基；所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基是在胚胎干细胞培养基中添加了GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基，优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基不添加MEK/ERK信号通路抑制剂，优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基不添加MEK/ERK信号通路抑制剂，优选地，所述胚胎干细胞培养基是无血清的，更优选地，所述胚胎干细胞培养基以DMEM/F
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12和Neurobasal作为基础培养基，另外添加了N2和B27，以及选自GlutaMAX，非必需氨基酸，微量元素，2
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巯基乙醇的一种或多种成分，更优选地，所述胚胎干细胞培养基不添加bFgf，更优选地，所述白血病抑制因子LIF的浓度在10
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30ng/mL的范围内，优选地，所述白血病抑制因子LIF的浓度为20ng/mL，更优选地，所述MEK/ERK信号通路抑制剂为PD0325901，优选地，所述PD0325901的浓度在0.1
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1.5μM的范围内，更优选地，所述PD0325901的浓度为1μM，更优选地，所述GSK3β信号通路抑制剂为CHIR99021，优选地，所述CHIR99021的浓度在2
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4μM的范围内，更优选地，所述CHIR99021的浓度为3μM，更优选地，所述酶为Accutase，优选地，所述粒细胞集落刺激因子GCSF的浓度在20
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40ng/mL的范围内，更优选地，所述GCSF的浓度为30ng/mL，优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在牛血清白蛋白或海藻糖中的GCSF，更优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在0.05％
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0.15％牛...

【专利技术属性】
技术研发人员：何塞，
申请(专利权)人：广州国家实验室，
类型：发明
国别省市：