一种联合免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种联合免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，该方法中，使用的联合免疫抑制剂为sCD83、TGF

【技术实现步骤摘要】
一种联合免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法


[0001]本专利技术涉及细胞生物学
，具体涉一种联合免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法。

技术介绍

[0002]自身免疫性疾病(autoimmune disease,AID)以自身多组织器官损伤、免疫紊乱为特征，被世界卫生组织(WHO)列为危害人类健康的杀手之一。该病患病率和致残率均很高，治愈率低，自身免疫性疾病的主要特征是机体缺乏对自身抗原的耐受，从而免疫系统过度激活，诱导了损伤性的免疫反应导致组织损伤。目前自身免疫性疾病主要的治疗方法是应用免疫抑制剂，然而长期应用免疫抑制剂，副作用大，感染和患肿瘤的风险增加。
[0003]细胞治疗是源于自体或异体的体细胞经体外培养诱导，产生具有某种免疫耐受功能的细胞，回输到自身免疫性疾病患者体内，抑制免疫系统的过度活化和组织损伤的一种治疗方案。细胞治疗安全性高且针对性较强，因此，日益受到人们的重视，使其成为一种富有前景的治疗方案，能够从调节免疫系统稳态角度有望成为治疗自身免疫性疾病的新方案。
[0004]树突状细胞(DC细胞)是激活适应性免疫的关键，不仅具有免疫协调作用，如清除外来入侵病毒、细菌等微生物感染，而且在稳定状态下可调节免疫系统、诱导免疫耐受，从而维持免疫系统平衡。来源于外周血的单核来源的耐受性DC细胞可在不干扰保护性免疫的情况下，消除病理性自身免疫或炎症反应，使免疫系统趋向于平衡，因而这种疗法可能提供持久的有益效果，甚至是治疗性的。
[0005]已报道组织基质细胞、细胞因子(IL<br/>‑
10、TGF
‑
β1)以及可溶性分子(sCD40L、sCTLA
‑
4)等可以调节DC细胞的功能状态。研究发现，在体外IL
‑
10、TGF
‑
β1刺激DC细胞比未刺激DC细胞表达低水平的共刺激分子，处于抑制状态；这种DC细胞在体外通过分泌IL
‑
10、IDO等能诱导同种异体T细胞产生较低的抗原特异性免疫反应；这种低表达共刺激分子和抑制性细胞因子，且在体内外能诱导T细胞低反应性的耐受的DC细胞统称为耐受性DC细胞。耐受性DC也被用于小鼠实验研究类风湿、多发性硬化症、自身免疫糖尿病等自身免疫病的治疗，但是无论是IL
‑
10、TGF
‑
β1或两者诱导得到的耐受性DC存在易受微环境影响、稳定性差、免疫抑制效果不好等问题，对制备具有强抑制功能的耐受性DC的优化是当前需解决的主要问题。
[0006]可溶性CD83(sCD83)分子，是一种糖蛋白，属于免疫球蛋白类。sCD83是CD83分子胞外区(CD83 ext)，由细胞膜上CD83在酶的作用下水解产生，具有抑制免疫反应的作用；已报道sCD83可在体外抑制DC细胞的成熟和膜上共刺激分子的表达，诱导DC的细胞骨架改变、促进分泌IDO从而促进调节性T细胞的产生，调控机体免疫平衡。多项研究表明sCD83不能直接影响T细胞的活性，而是通过抑制DC细胞间接抑制T细胞活化。
[0007]目前，已报道细胞因子(IL
‑
10和/或TGF
‑
β1)或者联合激素类药物可以诱导DC耐受，用于移植、自身免疫性疾病等的防治研究，也有关于利用药物通过抑制小鼠DCs表面共刺激分子的表达诱导DCs耐受，或者基因修饰IL
‑
10和TGF
‑
β1促进DC抑制功能，但这些方法
获得的DC耐受存在稳定性差、基因或药物干预影响细胞本身状态、活率低等缺点，影响耐受性DC的使用。

技术实现思路

[0008]针对现有技术的上述不足，本专利技术提供了一种联合免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，该方法中，使用的联合免疫抑制剂为sCD83、TGF
‑
β1和IL
‑
10。利用本专利技术提供的方法，能够从外周血中获得高活性、强免疫抑制功能的耐受性DC，这种DC可以在液氮中保存，复苏后具有较好的活性，能够满足临床对耐受性DC细胞制品的需求，用于预防和治疗自身免疫性疾病和防止移植排斥反应。
[0009]本专利技术的技术方案如下：
[0010]一种联合免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，该联合免疫抑制剂为sCD83、TGF
‑
β1和IL
‑
10。
[0011]优选的，上述方法的步骤如下：
[0012](1)采集外周血置于含50u/mL肝素钠抗凝管中，并加入PBS+2％FBS稀释液稀释，外周血和稀释液的体积比为1:1，用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离，得到外周血单个核细胞，用PBS+2％FBS缓冲液洗涤细胞，加入培养液培养1
‑
2小时，弃上清，取培养皿中贴壁DC前体细胞；
[0013](2)在细胞因子IL
‑
4、GM
‑
CSF作用下诱导DC前体细胞向DC分化，并在该过程中，在培养皿中添加联合免疫抑制剂(sCD83，TGF
‑
β1和IL
‑
10)诱导其分化为耐受性DC；得到的耐受性DC纯度＞95％，存活率＞95％，表达DC标志CD11c以及低表达共刺激分子CD80、CD83、CD86和HLA
‑
DR，能够分泌IL
‑
10和IDO；
[0014](3)将诱导培养的耐受性DC做功能鉴定，并保存于液氮中。
[0015]优选的，在步骤(1)中，培养液为含体积浓度10
‑
15％自体灭活血浆的1640培养液培养；其中，自体灭活血浆为和培养诱导的细胞同源的血浆。
[0016]优选的，在步骤(2)中，细胞因子诱导DC前体细胞向DC分化的过程为：取贴壁DC前体细胞，于含体积浓度10
‑
15％自体灭活血浆的1640培养液中培养7天，分别在第0、3、5天添加细胞因子IL
‑
4和GM
‑
CSF。
[0017]优选的，在第0天，细胞因子IL
‑
4的添加量为500u/mL，GM
‑
CSF的添加量为1000u/mL。
[0018]优选的，在步骤(2)中，于第5天、第7天分别添加联合免疫抑制剂，其中，sCD83的添加量为10ng/mL，TGF
‑
β1的添加量为0.2ng/mL，IL
‑
10的添加量为10ng/mL。
[0019]优选的，在步骤(3)中，向耐受性DC中加入冻存液预处理后，将耐受性DC以2
×
106/mL的密度分装入冻存管，于
‑
196℃液氮保存；其中，冻存液由10％DMSO和90％FBS组成。
[0020]耐受性树突状细胞制品是用于预防和治疗自身免疫性疾病和防止移植排斥反应的树突状细胞制品。
[0021]相对于现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0022本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种联合免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，其特征在于，该联合免疫抑制剂为sCD83、TGF
‑
β1和IL
‑
10。2.如权利要求1所述的联合免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，其特征在于，步骤如下：(1)采集外周血置于含50u/mL肝素钠抗凝管中，并加入PBS+2％FBS稀释液稀释，外周血和稀释液的体积比为1:1，用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离，得到外周血单个核细胞，用PBS+2％FBS缓冲液洗涤细胞，加入培养液培养1
‑
2小时，弃上清，取培养皿中贴壁DC前体细胞；(2)在细胞因子IL
‑
4、GM
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CSF作用下诱导DC前体细胞向DC分化，并在该过程中，在培养皿中添加联合免疫抑制剂诱导其分化为耐受性DC，得到的耐受性DC纯度＞95％，存活率＞95％，表达DC标志CD11c以及低表达共刺激分子CD80、CD83、CD86和HLA
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DR，能够分泌IL
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10和IDO；(3)将诱导培养的耐受性DC做功能鉴定，并保存于液氮中。3.如权利要求2所述的联合免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，其特征在于，在步骤(1)中，培养液为含体积浓度10
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15％自体灭活血浆的1640培养液培养；其中，自体灭活血浆为和...

【专利技术属性】
技术研发人员：林玮，付强，冯萌，李明浩，魏勋斌，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：