一种CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法，该制备方法包括如下步骤：在含有CD40信号激活剂的培养体系中，在体外将PBMC诱导分化为CLEC9A+XCR1+树突状细胞。其中，CD40信号激活剂为重组人CD40配体，优选重组人CD40L三聚体活性单位。培养体系还包括α

【技术实现步骤摘要】
一种CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法


[0001]本专利技术属于细胞生物学及医药
，具体涉及一种CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法。

技术介绍

[0002]传统的基于单核细胞衍生的树突状细胞(MoDCs)疫苗接种方法，尽管不断优化各种接种参数，但仅取得了适度的应答率。尽管临床数据表明，这些树突状细胞(DC)疫苗具有良好的耐受性和良好的安全性，但只有不到15％的患者获得了明确的治疗结果。入组晚期患者常见的肿瘤相关免疫抑制、选择肿瘤抗原作为靶点以及MoDCs功能受限是导致这种有效性缺失的原因。体外生成的MoDCs在与临床结果成功与否的关键方面表现不太好，这主要是MoDCs从注射部位向淋巴结迁移的能力和有效诱导强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应的能力不足。作为一种替代方法，循环天然树突状细胞(nDC)尽管在血液中很少存在，但显示出许多优势，使其成为癌症免疫治疗的一个有吸引力的来源。
[0003]多项研究表明，传统Ⅰ型树突状细胞(cDC1)在交叉提呈可溶性或颗粒状抗原方面优于传统Ⅱ型树突状细胞(cDC2)。cDC1，特别是CD141+XCR1+DC，除具有高度的交叉表达能力外，还能产生大量IL
‑
12和IL
‑
15，在促进NK和自然杀伤T(NKT)细胞致敏、活化方面具有优势。cDC1是最有效的人类交叉提呈细胞，是强有力的CTL诱导剂，这些功能性状是由CLEC9A和XCR1等分子的表达激活的。CLEC9A是坏死细胞暴露的肌动蛋白丝的受体，介导抗原识别、内化并进入交叉递呈通路。人CD141+DCs限制性表达XCR1，XCL1在NK和CD8+T细胞中有选择性地稳定表达，在感染和炎症反应中增强。XCL1
‑
XCR1轴促进NK和CD8+T细胞与CD141+XCR1+DC的物理接触，放大它们的激活状态。
[0004]利用CD141+XCR1+DC或增强其功能在癌症治疗领域是一个非常有前途和令人兴奋的目标。但XCR1+cDC1约占外周单个核细胞数量的0.02％，是最罕见的DC子集，需要通过强有力的体外扩增、诱导获得足够的数量和纯度。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术的问题，本专利技术提供了一种CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法。
[0006]本专利技术的具体技术方案如下：
[0007]本专利技术提供了一种CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：在含有CD40信号激活剂的培养体系中，在体外将PBMC诱导分化为CLEC9A+XCR1+树突状细胞。
[0008]本专利技术提供的CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法，还具有这样的技术特征，其中，CD40信号激活剂为重组人CD40配体(CD40L)。
[0009]本专利技术提供的CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法，还具有这样的技术特征，其中，重组人CD40配体为重组人CD40L三聚体活性单位(CD40L
‑
Tri)。
[0010]本专利技术提供的CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法，还具有这样的技术特征，其中，CD40信号激活剂的浓度为0.1
‑
10μg/ml，优选0.5
‑
4μg/ml。
[0011]本专利技术提供的CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法，还具有这样的技术特征，其中，CD40信号激活剂采用2
‑
5μg/ml 1
×
附着因子蛋白或重组人纤连蛋白稀释，并提前包被培养器皿，4℃避光孵育24h以上，优选采用重组人纤连蛋白(FN)溶液稀释包被培养器皿。
[0012]本专利技术提供的CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法，还具有这样的技术特征，其中，培养体系还包括α
‑
MEM、RPMI
‑
1640、IMDM中的一种，加入1
×
β
‑
巯基乙醇、1
×
胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂(1
×
ITS
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X)、重组人Flt3配体蛋白(Flt3L)、重组人干细胞因子(SCF)、重组人血小板生成素(TPO)、重组人粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(GM
‑
CSF)、重组人白介素4蛋白(IL
‑
4)以及自体血浆或重组人血白蛋白(HSA)。
[0013]本专利技术提供的CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法，还具有这样的技术特征，其中，重组人Flt3配体蛋白(Flt3L)的浓度为10
‑
500ng/ml，优选50
‑
100ng/ml；重组人干细胞因子(SCF)的浓度为10
‑
500ng/ml，优选20
‑
100ng/ml；重组人血小板生成素(TPO)的浓度为10
‑
500ng/ml，优选50
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200ng/ml；重组人粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(GM
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CSF)的浓度为2
‑
100ng/ml，优选2
‑
20ng/ml；重组人白介素4蛋白(IL
‑
4)的浓度为5
‑
100ng/ml，优选20
‑
100ng/ml；自体血浆的浓度为5
‑
10％；重组人血白蛋白(HSA)的浓度为0.1
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1％，优选0.2
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0.6％。
[0014]本专利技术提供的CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法，还具有这样的技术特征，其中，PBMC来源于脐带血、骨髓、动员外周血或非动员外周血。
[0015]本专利技术还提供了一种CLEC9A+XCR1+树突状细胞，其特征在于，采用上述CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法制备得到。
[0016]本专利技术还提供了一种CLEC9A+XCR1+树突状细胞疫苗，其特征在于，含有上述CLEC9A+XCR1+树突状细胞。
[0017]专利技术的作用与效果
[0018]本专利技术提供的CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法，能够在体外诱导分化CLEC9A+XCR1+树突状细胞，可获得纯度20％以上的CLEC9A+XCR1+树突状细胞。此外，该制备方法采用非动物源细胞因子和成分，无饲养层，制得的CLEC9A+XCR1+树突状细胞临床使用非常安全。
附图说明
[0019]图1是本专利技术实施例的CLEC9A+XCR1+树突状细胞诱导培养day0和day7的总细胞变化情况。
[0020]图2是本专利技术实施例的CLEC9A+XCR1+树突状细胞诱导培养day7时流式检测CLEC9A/XCR1的表达情况。
具体实施方式
[0021]在本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：在含有CD40信号激活剂的培养体系中，在体外将PBMC诱导分化为CLEC9A+XCR1+树突状细胞。2.根据权利要求1所述的CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法，其特征在于，其中，所述CD40信号激活剂为重组人CD40配体。3.根据权利要求2所述的CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法，其特征在于，其中，所述重组人CD40配体为重组人CD40L三聚体活性单位。4.根据权利要求1所述的CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法，其特征在于，其中，所述CD40信号激活剂的浓度为0.1
‑
10μg/ml。5.根据权利要求1所述的CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法，其特征在于，其中，所述CD40信号激活剂采用2
‑
5μg/ml 1
×
附着因子蛋白或重组人纤连蛋白稀释，并提前包被培养器皿，4℃避光孵育24h以上。6.根据权利要求1所述的CLEC9A+XCR1+树突状细胞的制备方法，其特征在于，其中，所述培养体系还包括α
‑
MEM、RPMI
‑
1640、IMDM中的一种，加入1
×
β
‑
巯基乙醇、1
×
胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：梁九林，张腾，罗卫峰，宋文文，
申请(专利权)人：浙江自贸区锐赛生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：