一种人源毛乳头细胞及其培养方法技术

本发明专利技术属于细胞培养技术领域，具体涉及一种人源毛乳头细胞及其培养方法。本发明专利技术的人源毛乳头细胞的培养方法包括以下步骤：步骤S01：待传代培养得到的Pn代细胞生长至汇合度80%

【技术实现步骤摘要】
一种人源毛乳头细胞及其培养方法


[0001]本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种人源毛乳头细胞及其培养方法。

技术介绍

[0002]在健康机体内，毛囊的毛乳头细胞（DPC）相互聚集形成的大小为几百微米的球状结构被称为毛乳头球。毛乳头球在毛囊真皮
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表皮交流中发挥关键作用，具有诱导毛囊形态发生和调控毛囊生长周期的功能。诸多研究证实，体外培养超过4代的DPC会丧失其诱导毛囊再生的能力，同时伴随多种细胞标志物表达的降低。因此，如何使DPC在经体外扩增后仍保持其毛发诱导能力，是高传代毛囊种子细胞实现毛囊重建再生的关键。
[0003]目前有多种方法能提高DPC的增殖、DPC标志物表达的恢复：表皮细胞的条件培养基（KC
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CM）和巨噬细胞外泌体以及其他人类细胞与DPC共培养。若要在体外恢复DPC的生物学特性和功能，就需要构建出一个能够模拟DPC在体内状态的仿生培养模型。DPCs的3D球体培养可以恢复DPCs 的诱导特性，与2D培养相比，3D培养技术中的细胞更接近复杂的体内条件。3D培养相对于2D培养条件的一个显着优势是减少了体外和体内细胞模型之间的差距。但3D培养也有一些缺点，由于球体内部细胞无法直接接触培养基，这可能导致营养不足无法长期培养。传统的3D悬滴成球费时费力且球体较为紧实，球体既难消化又无法贴壁培养。
[0004]因此，需要提供一种针对上述现有技术不足的改进技术方案。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种人源毛乳头细胞及其培养方法，以解决或改善体外培养时，单独采用2D培养会造成人源毛乳头细胞丧失诱导毛囊再生的能力，采用3D培养会造成人源毛乳头细胞不易贴壁、消化、不能长期培养的问题。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种人源毛乳头细胞的培养方法，包括以下步骤：步骤S01：待传代培养得到的Pn代细胞生长至汇合度80%
‑
95%时，收获细胞，并对收获得到的细胞进行3D成球培养，对经所述3D成球培养得到的毛乳头细胞再进行2D培养扩增，得到Pn+1代细胞；步骤S02：按照步骤S01对所述Pn+1代细胞进行多次传代培养，得到PN代细胞。
[0007]优选地，步骤S01中，所述3D成球培养在Poly
‑
HEMA包被处理的培养容器中进行。
[0008]优选地，所述Poly
‑
HEMA包被处理的培养容器通过采用10
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40 mg/mL的Poly
‑
HEMA对培养容器进行包被处理得到。
[0009]优选地，所述包被通过将Poly
‑
HEMA与所述培养容器共孵育，去除多余Poly
‑
HEMA后，晾干，即得Poly
‑
HEMA包被处理的培养容器；所述共孵育的温度为35
‑
40 ℃，所述共孵育的时间为4 h以上。
[0010]优选地，步骤S01中，所述3D成球培养的时间为1
‑
3天。
[0011]优选地，步骤S01中，所述3D成球培养时，细胞接种浓度为(1
‑
100)
×
10
3 cells/mL。
[0012]更优选地，步骤S01中，所述3D成球培养时，细胞接种浓度为(20
‑
60)
×
10
3 cells/mL。
[0013]优选地，所述Pn代细胞中，n≤2；所述PN代细胞中，N≤15。
[0014]更优选地，所述PN代细胞中，N≤8。
[0015]优选地，所述Pn代细胞细胞通过对原代毛乳头细胞进行传代培养得到，细胞生长至汇合度80%
‑
95%时进行传代。
[0016]优选地，所述原代毛乳头细胞通过对人源毛囊毛乳头进行贴壁培养得到。
[0017]本专利技术还提供了一种人源毛乳头细胞，其采用下述技术方案：一种人源毛乳头细胞，所述人源毛乳头细胞采用如上所述的方法培养得到。
[0018]有益效果：本专利技术的人源毛乳头细胞培养方法有助于提高人源毛乳头细胞的增殖，有助于实现人源毛乳头细胞的长期连续培养，维持人源毛乳头细胞标志物的表达。
[0019]本专利技术的人源毛乳头细胞培养方法有助于改善或解决人源毛乳头细胞3D成球培养后，无法传代及消化酶解的问题。
[0020]本专利技术的人源毛乳头细胞培养方法有助于改善或解决人源毛乳头细胞3D悬滴成球费时费力，且3D成球培养后，球体状细胞紧实而导致死细胞增多的问题，提高细胞存活率。
[0021]附图说明
[0022]构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。其中：图1为本专利技术实施例1提供的毛囊原代毛乳头组织的分离及贴壁后细胞传代生成图；其中，(a)为毛囊提取机提取毛囊样本图；(b)为毛囊样本组织在体式显微镜下剥离后获得DP毛乳头；(c)为剥离干净的毛乳头贴壁生长后细胞爬出第5天的细胞形态图。（d）毛乳头细胞P1代次收获前细胞形态图；(e)为毛乳头细胞P2代次收获前细胞形态图；图2为本专利技术实施例2不同浓度Poly
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HEMA处理6孔板，接种细胞成球培养，检测细胞非贴壁情况，横排分别为5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL浓度的polyPoly
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HEMA，纵列为37℃孵育2 h、4 h、6 h；图3为本专利技术实施例3不同浓度的细胞接种到6孔板中成球培养3天，统计细胞球状细胞的直径大小；图4为对比例2中，毛乳头细胞3D成球后采用不同消化酶消化不同时间后的细胞形态图；其中，(a)为毛乳头细胞3D成球后，消化前的球体；图(b)为毛乳头细胞3D球体用TrypLE消化30min后细胞形态图；(c)为毛乳头细胞3D球体用TrypLE消化50min后细胞形态图；(d)为毛乳头细胞3D球体用胶原酶A消化30min后细胞形态图；(e)为毛乳头细胞3D球体用胶原酶A消化50min后细胞形态图；图5为实施例2（2D/3D交替培养）传代培养得到的P8代细胞和对比例1（2D常规培养）传代培养得到的P3代人源毛乳头细胞的免疫荧光染色结果图；图示的每个marker中，左侧均为对比例1传代培养得到的P3代人源毛乳头细胞的检测结果图，右侧为实施例2传代培
养得到的P8代细胞的检测结果图；所有marker均呈现绿色荧光，蓝色荧光为DAPI。
[0023]图6为实施例2（2D/3D交替培养）传代培养得到的P8代细胞和对比例1（2D常规培养）传代培养得到的P3代人源毛乳头细胞的实时荧光定量检测结果图；图7为实施例2（2D/3D交替培养）传代培养得到的P8代细胞和对比例1（2D常规培养）传代培养得到的P3代人源毛乳头细胞的碱性磷酸酶染色结果图；图8为本专利技术一种实施例的人源毛乳本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人源毛乳头细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S01：待传代培养得到的Pn代细胞生长至汇合度80%
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95%时，收获细胞，并对收获得到的细胞进行3D成球培养，对经所述3D成球培养得到的毛乳头细胞再进行2D培养扩增，得到Pn+1代细胞；步骤S02：按照步骤S01对所述Pn+1代细胞进行多次传代培养，得到PN代细胞。2.根据权利要求1所述的人源毛乳头细胞的培养方法，其特征在于，步骤S01中，所述3D成球培养在Poly
‑
HEMA包被处理的培养容器中进行。3.根据权利要求2所述的人源毛乳头细胞的培养方法，其特征在于，所述Poly
‑
HEMA包被处理的培养容器通过采用10
‑
40 mg/mL的Poly
‑
HEMA对培养容器进行包被处理得到。4.根据权利要求3所述的人源毛乳头细胞的培养方法，其特征在于，所述包被通过将Poly
‑
HEMA与所述培养容器共孵育，去除多余Poly
‑
HEMA后，晾干，即得Poly
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HE...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄莹之，方攀峰，禹雨，韩冬梅，
申请(专利权)人：宁波希诺赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：