一种人脐静脉内皮细胞及其分离方法和培养方法技术

本申请涉及细胞分离培养的技术领域，具体公开了一种人脐静脉内皮细胞及其分离方法和培养方法。本申请提供的人脐静脉内皮细胞，具有细胞纯度高、活细胞率高、繁殖速度快以及传代次数多的优势。本申请提供的人脐静脉内皮细胞的分离方法，在向脐静脉内注入液体时，将液体通过连接件从静脉口注入脐静脉中；连接件包括入料口、出料口和过滤除菌部，出料口的外径为2.0

【技术实现步骤摘要】
一种人脐静脉内皮细胞及其分离方法和培养方法


[0001]本申请涉及细胞分离培养的领域，更具体地说，涉及一种人脐静脉内皮细胞及其分离方法和培养方法。

技术介绍

[0002]血管内皮细胞覆盖于血管内膜表面，是一种单层扁平上皮细胞。血管内皮细胞可合成和分泌多种结缔组织成分，参与细胞代谢；还可分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。血管内皮生长因子包括VEGF
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A、VEGF
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B、VEGF
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C、VEGF
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D、VEGF
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E和胎盘生长因子。研究表明，血管内皮生长因子在调节机体内环境稳定、维持正常生理和免疫功能等方面发挥重要作用。VEGF
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A可促进新生血管形成和使血管通透性增加；VEGF
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B在非新生血管形成的肿瘤中起作用；VEGF
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C和VEGF
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D在癌组织的新生血管和新生淋巴管的形成过程中起作用；VEGF
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E也是一种潜在的新生血管形成因子；胎盘生长因子可促进新生血管形成，使血管通透性增加。
[0003]因此，血管内皮细胞与感染、免疫、肿瘤和心血管等疾病密切相关，具有重要的研究和应用价值。
[0004]脐静脉是体外提取血管内皮细胞的主要来源，具有易获取、细胞无任何病理生理过程以及纯度较高等优点。人脐静脉细胞的分离方法可分为机械法和酶消化法，酶消化法相比于机械法不容易混入其他细胞(如平滑肌细胞)，且更加温和，对细胞损伤较小，但是仍然存在操作不够简便、耗时较长、容易污染等问题，分离得到的细胞在活细胞率、繁殖速度和传代能力等方面不够理想，制约了血管内皮细胞相关的研究和应用。因此，如何有效提高人脐静脉内皮细胞的活力已成为亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]为了提高人脐静脉内皮细胞的活力，本申请提供一种人脐静脉内皮细胞及其分离方法和培养方法。
[0006]第一方面，本申请提供一种人脐静脉内皮细胞，采用如下的技术方案：一种人脐静脉内皮细胞，保藏编号为CCTCC NO:C202271。
[0007]本申请提供的人脐静脉内皮细胞，具有良好的活力，具体表现为活细胞率高、细胞纯度高、繁殖速度快、传代次数多，具有重要的研究和应用价值。
[0008]第二方面，本申请提供一种上述人脐静脉内皮细胞的分离方法，采用如下技术方案：在向脐静脉内注入液体时，将液体通过连接件从静脉口注入脐静脉中；上述连接件包括入料口、出料口和过滤除菌部，出料口的外径为2.0
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2.5mm；上述出料口插入静脉口，并利用夹具将出料口与静脉口重合的位置夹紧。
[0009]上述液体可以为洗涤液、消化液或细胞培养基。
[0010]在细胞分离过程中，包括从脐静脉一端注入洗涤液，开放脐静脉另一端，将脐静脉
内残留血液冲出脐静脉的步骤；以及从脐静脉一端注入消化液，封闭脐静脉另一端，使消化液充盈脐静脉的步骤；还有消化完成后，从脐静脉一端注入细胞培养基，开放脐静脉另一端，将消化液冲出脐静脉的步骤。
[0011]目前，在分离人脐静脉内皮细胞时，多采用注射器通过插入脐静脉中的平针头向脐静脉中注入液体。由于脐静脉管壁瘪陷，注入的液体向脐静脉内部流动的阻力大，容易从静脉口处漏出脐静脉之外。目前常用丝线扎紧的方式固定平头针并避免液体从静脉口处漏出。但是，在实际操作过程中，针头容易戳破脐静脉，增大细胞污染几率；同时，由于脐带组织表面存在华通式胶，非常光滑，用丝线扎紧操作难度大，耗时长，而且，扎紧后的丝线也容易滑脱，进一步增大细胞污染几率。
[0012]使用平头针向脐静脉内注入液体的情况下，当注射器与平头针之间拔插时，容易导致针头戳破脐静脉组织，或导致丝线滑脱，操作难度大，极易导致污染。消化完成后，用完全培养基将消化液从脐静脉中冲出以收集细胞时，增加冲洗次数能够有效提高分离获得的细胞数量，由于注射器与平头针之间拔插不方便，针头易从血管滑脱并需要重新结扎，加大操作污染几率，所以使用平头针时一般只能冲洗一次，因此导致细胞冲洗不完全，分离获得的细胞数量较少。
[0013]本申请提供的人脐静脉细胞系的分离方法，将液体的出料口设置为2.0
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2.5mm。一方面，与使用平头针作为液体的出料口相比，增大了液体的出料口的外径，同时出料口的钝性设计避免了滤膜出料口戳破脐静脉的情况发生，有效减少细胞污染概率。另一方面，由于脐静脉的内径在1.0
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1.7mm之间且脐静脉富有弹性，外径为2.0
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2.5mm的出料口刚好可以插入静脉口中且与静脉口无缝衔接，避免了液体从出料口的外壁与静脉口的内壁之间的缝隙中漏出；而且，仅需使用夹具即可将出料口与静脉口连接的位置固定而不漏液，与使用丝线扎紧相比，操作简单，有效节省了细胞分离过程的时间。
[0014]在分离人脐静脉内皮细胞的过程中，所用到的洗涤液和消化液等液体随着实验操作的进行，污染概率不断增加。本申请在连接件的入料口和出料口之间，增加了过滤除菌部，有效降低了由注入的液体污染导致细胞污染的概率。
[0015]组织的新鲜程度对于原代细胞的活细胞率、活细胞数以及细胞传代培养过程中的活力非常重要，因此细胞分离操作的用时越短，所分离获得的细胞活力越好。细胞分离操作过程中的污染会直接导致细胞分离的失败。本申请提供的人脐静脉细胞的分离方法，大幅减少了细胞污染概率，有效提高了细胞分离的成功率；大幅节省了操作时间，有效提高了分离得到的人脐静脉内皮细胞的活细胞率、繁殖速度和传代能力。
[0016]进一步地，上述夹具为止血钳、镊子或脐带夹。
[0017]进一步地，上述连接件为针头式过滤器，上述针头式过滤器的滤膜的孔径小于或等于0.22μm。
[0018]本申请中的针头式过滤器，采用0.22μm及以下的滤膜孔径，可以过滤液体中的微生物，有效避免细胞污染。针头式过滤器还可以与注射器配合使用。注射器作为转移液体的工具，针头式过滤器作为静脉口与注射器之间的连接件。每次向注射器内补充液体时，将针头式过滤器滞留在静脉口处，只在针头式过滤器和注射器之间进行拔插，操作简便快捷，进一步节省了操作时间，减小了污染概率，从而进一步提高分离得到的人脐静脉内皮细胞的活细胞率、繁殖速度和传代能力。
[0019]消化完成后，用细胞培养基将消化液从脐静脉中冲出以收集细胞时，由于针头式过滤器与注射器之间拔插方便，所以可以反复使用注射器吸取新的细胞培养基，对脐静脉进行充分冲洗，从而有效提高分离获得的人脐静脉内皮细胞的细胞数量。
[0020]进一步地，上述分离方法包括消化细胞的步骤；在消化细胞的步骤中，向脐静脉内注入消化液，封闭脐静脉两端；在封闭脐静脉时，采用夹闭的操作。
[0021]将消化液注入脐静脉后，需要封闭脐静脉两端，对细胞进行消化。本申请采用夹闭的方式封闭脐静脉两端，与使用丝线结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人脐静脉内皮细胞，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO: C202271。2.一种权利要求1所述的人脐静脉内皮细胞的分离方法，其特征在于，所述分离方法在向脐静脉内注入液体时，将所述液体通过连接件从静脉口注入所述脐静脉中；所述连接件包括入料口、出料口和过滤除菌部，所述出料口外径为2.0
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2.5 mm；所述出料口插入所述静脉口，并利用夹具将所述出料口与所述静脉口重合的位置夹紧。3.根据权利要求2所述的人脐静脉内皮细胞的分离方法，其特征在于，所述夹具为止血钳、镊子或脐带夹。4.根据权利要求2所述的人脐静脉内皮细胞的分离方法，其特征在于，所述连接件为针头式过滤器，所述针头式过滤器的滤膜的孔径小于或等于0.22 μm。5.根据权利要求2所述的人脐静脉内皮细胞的分离方法，其特征在于，所述分离方法包括消化细胞的步骤；所述消化细胞的步骤中，向脐静脉内注入消化液，封闭脐静脉...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭瑞敏，刘宇宁，曹毓琳，
申请(专利权)人：唐颐生物医学天津有限公司，
类型：发明
国别省市：