一种模拟神经肌肉接头疾病的人源性类器官模型构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及类器官构建方法，该方法以人源诱导性多能干细胞(iPSCs)为基础，通过诱导神经中胚层前体细胞(NMPs)，并进一步经3D培养形成神经肌肉接头类器官(NMOs)。本发明专利技术提供了关于NMOs诱导及维持所需的一系列的关键步骤(指标)。这些方法和指标已扩展到多种不同来源iPSCs诱导的NMOs的培养，可实现批次间和个体间的均一化。同时，本发明专利技术通过对杜氏肌肉萎缩疾病NMOs进行构建，首次形成了具备DMD生物学特征相关的神经肌肉接头类器官。另外，本发明专利技术所获得的模型能够模拟的疾病不限于神经肌肉类疾病模型，也能够适用于其他类型疾病如运动系统损伤、药理毒理检测、衰老及营养学模型等。衰老及营养学模型等。衰老及营养学模型等。

【技术实现步骤摘要】
一种模拟神经肌肉接头疾病的人源性类器官模型构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及干细胞培养以及类器官构建领域，特别是涉及一种建立体外模拟神经肌肉接头疾病的人源性类器官的诱导方法、所述类器官的评价体系及其相关应用。

技术介绍

[0002]神经肌肉接头疾病是一类以运动系统障碍为症状并且牵涉到神经功能失调及(或)肌肉病变为临床特征的疾病。以疾病过程中主要受累组织作为区分，该类疾病可分为肌肉系统病变导致的运动系统障碍，如杜氏肌肉萎缩(Duchenne muscular dystrophy,DMD)、贝克氏肌肉萎缩(Becker's muscular dystrophy,BMD)；以及由于运动神经元、尤其是脊髓运动神经元退行性病变导致的运动功能失调，如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)及重症肌无力(Myasthenia gravis,MG)等(1
‑
3)。
[0003]目前的神经肌肉接头疾病或运动神经系统类型疾病的模型以啮齿类动物模型为主。虽然啮齿类动物模型具有哺乳动物特征性的完整身体结构，但是现有的啮齿类动物模型很难满足高通量筛选的需求。此外，啮齿类动物模型也并不能完全模拟人类多数组织的生理功能。
[0004]随着人源性诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的发展，以iPSCs为基础诱导的3D类器官正逐步成为模拟复杂疾病及高通量筛选的新模型。截至目前，已经陆续报道了由类器官模拟的脑、肺、肝脏及肠道等组织模型。这些模型能够模拟相应系统的疾病，建立相应的标准化方法，并进行稳定性评价以及病理特征分析。因此，这些模型能够极大地弥补以下各类需求：针对复杂疾病的药物研发、相应分子机制的研究及生物样本库的构建等。
[0005]已经大量报道了人源性、尤其是患者来源的iPSCs诱导的运动神经元以及运动神经元与诱导型肌肉组织的共培养体系(4)。此类体系多以2D培养的细胞结构为主，并且除了神经肌肉接头外，该体系缺乏生理状态下其他组织细胞之间的相互作用，例如局部神经环路、神经与胶质细胞之间的相互作用等。
[0006]2020年，Martins等人在《Cell Stem Cell》发表了有关人源性神经肌肉接头类器官(Neuromuscular organoids,NMOs)的文献(5)。在该文献中，通过对不同诱导阶段的关键生物学标记测试，Martins等人发现NMOs具备运动系统中脊髓运动神经元、中间神经元、神经胶质细胞及骨骼肌等多种组织、细胞类型，并且骨骼肌及神经元均具备电生理功能(5)。作为利用不同个体iPSCs来源而产生的3D类器官，其诱导过程中的批次和个体差异以及生物学表型的判断与质控是3D类器官对疾病模拟及高通量筛选首先要解决的问题。
[0007]然而，该3D类器官是否能够模拟绝大多数神经肌肉接头类疾病，并且满足高通量筛选的要求则尚无定论。

技术实现思路

[0008]本申请的目的是提供一种新型模拟神经肌肉接头类型疾病的3D体外模型。该模型以人源性iPSCs或胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)为基础，以自组装方式形成3D神经肌肉接头类器官。本专利技术包括NMOs诱导的方法、关键步骤、模型稳定性的评价手段及疾病模拟的检测手段。
[0009]本专利技术公开了一种用于研究神经肌肉接头疾病及其他相关功能的类器官及其构建、培养、评价方法。
[0010]本专利技术涉及一种建立体外神经肌肉接头类器官的诱导方法、评价体系及其应用。
[0011]本专利技术的方法以人源诱导性多能干细胞(iPSCs)和/或胚胎干细胞(ESCs)为基础，通过诱导神经中胚层前体细胞(Neuromesodermal progenitors,NMPs)，并进一步经3D培养形成神经肌肉接头类器官(NMOs)。
[0012]本专利技术人发现了关于NMOs诱导及维持所需的一系列的关键步骤(指标)，包括NMPs诱导时间以及诱导标准。具体细节包括：1)研究者初次对iPSCs进行诱导时应对NMPs的诱导天数进行预实验，设计包括1.5天、2天、2.5天和3天的时间点。2)接种密度可设计为70,000个细胞/cm2及35,000个细胞/cm2。3)NMPs通过免疫荧光共染SOX2及Brachyury判断，双阳性率80％以上可认定为充分诱导。同时，本专利技术强调了NMPs的诱导关键要素即避免诱导过程中细胞生长密度过高。
[0013]本专利技术还进一步提供了NMPs的接种密度及NMOs的诱导标准。具体细节包括：1)可根据研究需要将NMPs接种密度设置每孔5,000～20,000个细胞的接种密度。2)在NMOs诱导起始，培养基成分为基础培养基加bFGF(10ng/ml)，HGF(2ng/ml)和IGF(2ng/ml)，及Y27632(50μM)。次日，每孔吸去50μl培养基，并加入基础培养基加HGF(2ng/ml)和IGF(2ng/ml)至第3日。第3日，吸去100μl培养基并加入100μl含有HGF(2ng/ml)和IGF(2ng/ml)的基础培养基。第4日，每孔直接加入100μl无生长因子的基础培养基。保持每日每孔更换100μl基础培养基。至第8日，NMOs平均尺寸(长度)超过约600μm则证实诱导成功。
[0014]本专利技术的这些方法和指标已扩展到多种不同来源iPSCs诱导的NMOs的培养，能够实现批次间和个体间的均一化。特别是对疾病患者来源iPSCs的诱导，这些步骤对模型的建立和对疾病特异性的生物学表型的模拟至关重要。本专利技术所公开的方法包括：1)对神经中胚层前体细胞(NMPs)的诱导的实验手段、培养基成分、诱导时间及其他事项；2)对NMOs形成的培养方法、培养基成分、关键诱导步骤；3)对疾病模型的构建及评价方法。同时，本专利技术通过对杜氏肌肉萎缩DMD疾病的NMOs进行构建，首次形成了具备ALS、DMD生物学特征相关的神经肌肉接头类器官，证实本专利技术的NMOs能够作为模拟神经肌肉接头疾病并适合高通量筛选的人源性体外3D组织模型。
[0015]因此，在一方面，本专利技术提供形成3D类器官的方法，包括：
[0016]i)提供诱导性多能干细胞(iPSCs)和/或胚胎干细胞(ESCs)；
[0017]ii)将iPSCs和/或ESCs细胞诱导成神经中胚层前体细胞(NMPs)；
[0018]iii)将NMPs细胞培养成3D类器官；
[0019]其中ii)中，iPSCs和/或ESCs细胞的接种密度可设定为2,000个细胞/cm2至100,000个细胞/cm2，任选地选自可设定为70,000个细胞/cm2和35,000个细胞/cm2用于条件摸索，诱导时间为1.5至3天(1.5天、2天、2.5天和3天)，任选地根据对BRA及SOX2双阳性细胞比
率检测(>80％)可选择适合密度及诱导时间，
[0020]其本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.形成3D类器官的方法，包括：i)提供诱导性多能干细胞(iPSCs)和/或胚胎干细胞(ESCs)；ii)将iPSCs和/或ESCs细胞诱导成神经中胚层前体细胞(NMPs)；iii)将NMPs细胞培养成3D类器官；其中ii)中，iPSCs和/或ESCs细胞的接种密度为2,000个细胞/cm2至100,000个细胞/cm2，任选地选自70,000个细胞/cm2和35,000个细胞/cm2，诱导时间为1.5至3天，任选地选自1.5天、2天、2.5天和3天，任选地根据对BRA及SOX2双阳性细胞比率检测(>80％)可选择适合密度及诱导时间；其中iii)中，NMPs细胞的接种密度设置5,000～20,000个细胞每孔的接种密度，其中任选地将NMPs细胞接种于96孔培养板，进一步任选地96孔超低吸附U型底培养板；其中任选地，将iPSCs和/或ESCs细胞诱导成NMPs比率达到80％以上，并且进一步任选地，将NMPs细胞的汇合度维持在70％以下；其中任选地，3D类器官的平均尺寸(长度)超过约600μm。2.根据权利要求1所述的方法，其中提供3～5代内iPSCs和/或ESCs细胞，并且任选地，iPSCs和/或ESCs细胞克隆生长至汇合度为70～80％。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在诱导第1天，采用NMPs基础培养基并同时加入Y27632培养iPSCs和/或ESCs细胞，任选地，所述Y27632为10
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50μM的Y27632，进一步任选地，所述Y27632为50μM的Y27632；其中培养24小时后换液并撤去Y27632，继续培养24小时至细胞汇合度为50～70％，获得NMPs细胞。4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中将诱导得到的NMPs细胞消化并制备单细胞悬液，离心后用第一培养基重悬，培养24小时至NMPs形成球形结构，加入第二培养基，培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷凯，高充，
申请(专利权)人：西湖大学，
类型：发明
国别省市：