一种3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法技术

本发明专利技术属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法。本发明专利技术的一种3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法包括下述步骤：(1)先后采用第一消化液和第二消化液对羊膜组织进行消化，分离得到羊膜间充质干细胞；(2)对经步骤(1)处理得到的羊膜间充质干细胞进行培养，得到P0代羊膜间充质干细胞；(3)对P0代羊膜间充质干细胞进行3D生物反应器培养，得到P1代羊膜间充质干细胞；(4)对P1代细胞进行冻存，即得种子库。本发明专利技术的3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法可在较短的体外培养时间下，得到传代次数少(P1代细胞)的种子库细胞，可保持较好的干性和归巢性，有助于发挥其临床效果。有助于发挥其临床效果。有助于发挥其临床效果。

【技术实现步骤摘要】
一种3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法


[0001]本专利技术属于干细胞培养
，具体涉及一种3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法。

技术介绍

[0002]羊膜是胚胎期发育的产物，位于胎盘的最内层，不含血管，细胞成分相对简单，主要由外胚层的上皮细胞和中胚层的间充质干细胞组成，具有来源丰富、无创操作、分离过程简单，具有很强的分化潜能以及低免疫原性等优势，同时胎盘在胎儿娩出后即成为废弃物，无伦理争议，是理想的间充质干细胞临床研究及应用来源。
[0003]目前通常使用酶解法对羊膜进行消化，如胰蛋白酶和胶原酶，消化后细胞进行接种培养，从而获得羊膜间充质干细胞。但是使用胰蛋白酶消化存在诸多问题，如对细胞损伤大，消化时间长，消化下来的细胞不容易保持细胞的干性，不易贴壁生长，细胞成活率低，细胞不纯以及P0代细胞得率过低等。
[0004]因此，需要提供一种针对上述现有技术不足的改进技术方案。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，以解决或改善现有技术中提取羊膜间充质干细胞的过程中，采用胰蛋白酶消化而造成的对细胞损伤大、消化时间长、消化得到的细胞不容易保持细胞干性、不易贴壁生长、细胞存活率低、细胞不纯和P0代细胞得率过低中的至少一项问题。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，包括下述步骤：(1)先后采用第一消化液和第二消化液对羊膜组织进行消化，消化结束后除去所述第二消化液，分离得到原代羊膜间充质干细胞；(2)对经步骤(1)处理得到的所述原代羊膜间充质干细胞进行培养，待细胞融合度达到80％
‑
90％时，采用胰酶替代物消化，得到P0代羊膜间充质干细胞；(3)对所述P0代羊膜间充质干细胞进行3D生物反应器培养，得到P1代羊膜间充质干细胞；(4)对所述P1代细胞进行冻存，即得所述种子库；所述第一消化液包括胰酶替代物和分散酶；所述第二消化液包括胶原酶A和脱氧核糖核酸酶I。
[0007]优选地，所述胰酶替代物为Tryple Select，浓度为1X；所述分散酶的浓度为1
‑
3mg/mL。
[0008]优选地，所述第二消化液中，胶原酶A的浓度为1
‑
3mg/mL，脱氧核糖核酸酶I的浓度为50
‑
200U/mL。
[0009]优选地，所述生物反应器内含有微载体；所述生物反应器中接种的细胞浓度为(1
‑
3)
×
107cells/g微载体。
[0010]优选地，步骤(3)中：培养结束后，先采用微载体裂解液裂解所述微载体，释放细胞；再采用Tryple Select对所得细胞进行消化；所述微载体裂解液的浓度为1.5X；所述
Tryple Select的浓度为1X。
[0011]优选地，所述生物反应器的培养条件为：pH7.3
‑
7.4，温度36.8
‑
37.2℃。
[0012]优选地，所述P0代羊膜间充质干细胞接种于生物反应器后，搅拌条件为：A.D0先35
‑
40rpm搅拌5
‑
10min，再0
‑
1rpm搅拌50
‑
70min，循环24次；B.D1
‑
D2 35
‑
40rpm恒速搅拌；C.D3
‑
D5 40
‑
45rpm恒速搅拌；步骤B中，还包括向所述生物反应器中补加培养基的步骤；步骤C中，还包括更换培养基的步骤：若所述生物反应器中，葡萄糖含量降低至初始葡萄糖含量的2/3，更换1/3培养基；若所述生物反应器中，葡萄糖含量降低至初始葡萄糖含量的1/2，更换1/2培养基。
[0013]优选地，步骤(1)中，所述消化在37℃恒温摇床中进行，所述恒温摇床的转速为100
‑
200rpm；所述第一消化液消化的时间为1
‑
2h，除去所述第一消化液的步骤包括过100目筛和PBS漂洗；所述第二消化液消化的时间为1.5
‑
2h，除去所述第二消化液的步骤包括离心，所述离心的离心力为400g，离心时间为5
‑
10min。
[0014]优选地，步骤(1)之前还包括采用清洗液对羊膜进行清洗并剪成所述羊膜组织的步骤；所述清洗液为含0.2％
‑
0.6％庆大霉素的磷酸盐缓冲液；步骤(1)中，所述第一消化液与所述羊膜组织的体积比为1:1；所述第二消化液与经所述第一消化液处理所得产物的体积比为1:1；所述羊膜组织为(1
‑
3)cm
×
(1
‑
3)cm的组织块。
[0015]优选地，步骤(2)和(3)中所采用的培养基为T4完全培养基；所述T4完全培养基包括T4间充质干细胞基础培养基和终浓度为1
‑
10％的血小板裂解液。
[0016]有益效果：
[0017]本专利技术的3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法通过先后采用第一消化液和第二消化液来对羊膜进行消化，以便于在羊膜间充质干细胞提取时，能够更有效地从羊膜组织中分离羊膜间充质干细胞，提高P0代细胞得率；且提取得到的羊膜间充质干细胞活性好、纯度高、工艺重复性好。
[0018]本专利技术的3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法通过采用特定的羊膜消化液，并结合两步消化法对羊膜间充质干细胞进行分离，分离效果好。
[0019]本专利技术的3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法中，可在较短的体外培养时间下，获取更多的羊膜间充质干细胞。
[0020]本专利技术的3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，可采用3D生物反应器进行种子库细胞培养，可实现大规模培养，有利于实现细胞疗法的商业化，后续的临床使用可以辐射更多的患者，填补目前临床需求的空白。
[0021]本专利技术的3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法得到的种子库细胞的传代次数少(P1代细胞)，体外扩张时间短，更容易保持较好的干性和归巢性，有助于发挥其临床效果。
附图说明
[0022]构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。其中：
[0023]图1为本专利技术实施例提供的从羊膜中分离得到的羊膜间充质干细胞的三阳五阴流式检测结果图。
具体实施方式
[0024]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0025]下面将结合实施例来详细说明本专利技术。需要说明的是，在不冲突的情况下，本专利技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)先后采用第一消化液和第二消化液对羊膜组织进行消化，消化结束后除去所述第二消化液，分离得到原代羊膜间充质干细胞；(2)对经步骤(1)处理得到的所述原代羊膜间充质干细胞进行培养，待细胞融合度达到80％
‑
90％时，采用胰酶替代物消化，得到P0代羊膜间充质干细胞；(3)对所述P0代羊膜间充质干细胞进行3D生物反应器培养，得到P1代羊膜间充质干细胞；(4)对所述P1代细胞进行冻存，即得所述种子库；所述第一消化液包括胰酶替代物和分散酶；所述第二消化液包括胶原酶A和脱氧核糖核酸酶I。2.根据权利要求1所述的3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，其特征在于，所述胰酶替代物为Tryple Select，浓度为1X；所述分散酶的浓度为1
‑
3mg/mL。3.根据权利要求1所述的3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，其特征在于，所述第二消化液中，胶原酶A的浓度为1
‑
3mg/mL，脱氧核糖核酸酶I的浓度为50
‑
200U/mL。4.根据权利要求1所述的3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，其特征在于，所述生物反应器内含有微载体；所述生物反应器中接种的细胞浓度为(1
‑
3)
×
107cells/g微载体。5.根据权利要求4所述的3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，其特征在于，步骤(3)中：培养结束后，先采用微载体裂解液裂解所述微载体，释放细胞；再采用Tryple Select对所得细胞进行消化；所述微载体裂解液的浓度为1.5X；所述Tryple Select的浓度为1X。6.根据权利要求5所述的3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，其特征在于，所述生物反应器的培养条件为：pH7.3
‑
7.4，温度36.8
‑
37.2℃。7.根据权利要求5所述的3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，其特征在于，所述P0代羊膜间充质干细胞接种于生物反应器后，搅拌条件为：A.D0先35
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄莹之，沈甜甜，闫占海，梅寒，禹雨，
申请(专利权)人：宁波希诺赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：