一种制备间充质干细胞的方法、间充质干细胞和应用技术

本发明专利技术提供了一种制备间充质干细胞（MSC）的方法、间充质干细胞和应用。该方法通过诱导EPSC分化获得滋养层干细胞（TSC），进一步诱导TSC分化获得成熟稳定的MSC，大大提高了MSC产量。本发明专利技术分化获得的MSC增殖速度较快，倍增时间约1.5天，且连续传代16次或更多，间充质干细胞表面标志表达水平仍保持正常，通过该传代可大量制备EPSC来源的MSC；此外，本发明专利技术制备的MSC具有分泌较高水平FGF4的能力，有利于开发成为一种治疗2型糖尿病的细胞治疗剂。成为一种治疗2型糖尿病的细胞治疗剂。成为一种治疗2型糖尿病的细胞治疗剂。

【技术实现步骤摘要】
一种制备间充质干细胞的方法、间充质干细胞和应用


[0001]本专利技术涉及细胞生物学领域，具体涉及一种制备间充质干细胞的方法、间充质干细胞和应用。

技术介绍

[0002]2017年，剑桥大学韦尔科姆基金会桑格研究所刘澎涛博士领导的团队首次利用小鼠发育最初期的4
‑
8个细胞胚胎，培育出了一种全能干细胞系——扩展多潜能干细胞（Expanded Potential Stem Cells，EPSC）。新细胞不仅能发育成任何类型的细胞，且发育潜力超过胚胎干细胞（ESC）和诱导性多能干细胞（iPSC）等，对人类的再生医学意义重大，有望为研究治疗流产和发育紊乱问题开辟新方向（Establishment of mouse expanded potential stem cells）。
[0003]随后，邓宏魁研究组利用EPSC细胞建立了快速制备基因修饰动物模型的技术(Li et al.， 2019a)，并利用人EPSC细胞高效制备功能性肝细胞（EPS
‑
Heps）(Wang et al.， 2020)，与传统人多能干细胞制备的肝细胞相比，EPS
‑
Heps在转录谱上更类似于人原代肝细胞。该研究结果突出了EPSC细胞产生功能性细胞的应用潜力，可以为体外制备功能细胞提供更好的来源。为了突破EPSC培养依赖饲养层细胞的制约，邓宏魁研究组通过对饲养层分泌的细胞因子和胞外基质等进行研究，建立了成分确定的，无异源的培养体系（xeno
‑
free EPS culture condition）。无饲养层、无异源体系培养的人EPCS细胞能够在体外长期稳定地培养60代以上，且能维持人EPSC细胞的基本性质（Chemically defined and xeno
‑
free culture condition for human extended pluripotent stem cells）。
[0004]间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSC）是Freidenstein等于1976年首次在骨髓里发现的一群贴壁生长细胞，形态和成纤维细胞相似，呈克隆性增殖。后研究发现间充质干细胞来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，广泛存在于人体多种组织中，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等潜能。
[0005]间充质干细胞可以从各种人体组织如骨髓中分离出来， 脂肪组织，脐带血，外周血，新生儿组织，胎盘等，但是可从成人组织中获得的间充质干细胞的数量有限，并且需要侵入性程序来分离间充质干细胞，并且会给供体带来意想不到的风险。
[0006]作为这些成体来源的间充质干细胞的替代方案，现有技术已报道了由诱导人多能干细胞分化为间充质干细胞的方法。然而，迄今为止已知的方法存在周期较长、产量较低、异种病原体污染等问题，不利于间充质干细胞作为细胞治疗剂的商品化。例如，专利申请CN110713973B依次对多能干细胞诱导分化成前体间充质干细胞以及成熟间充质干细胞，分化时间长达30天。Xiaofang Wang 等（Immune modulatory mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells through a trophoblast
‑
like stage）通过诱导类滋养层干细胞分化最终获得MSC，分化时间虽然缩短了，但是后续的传代时间约10天，细胞增殖缓慢，且传代5代后细胞开始出现衰老；专利申请CN114540282A中通过将iPSC形成拟胚体诱导MSC分化，分化方案比较复杂，且最后获得的MSC可能纯度不高。目前，也没
有关于由EPSC分化制备MSC的文献报道。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种制备间充质干细胞的方法，本专利技术首次以扩展多潜能干细胞为起始细胞，解决了现有技术诱导分化时间较长、传代时间长、细胞增殖缓慢的问题，无血清无异种来源的培养体系解决了安全性问题，并且即使在重复传代培养后，间充质干细胞的特性也得以长期保持。
[0008]本专利技术的另一个目的是提供由该方法制备的间充质干细胞。
[0009]为实现上述目的，本专利技术提供了一种制备间充质干细胞的方法，包括：1）提供扩展多潜能干细胞或包括扩展多潜能干细胞的细胞培养物；2）将所述扩展多潜能干细胞或包括扩展多潜能干细胞的细胞培养物置于滋养层干细胞分化培养基中培养，得到滋养层干细胞或包括滋养层干细胞的细胞培养物；3）将所述滋养层干细胞或包括滋养层干细胞的细胞培养物置于间充质干细胞分化培养基中培养，得到间充质干细胞或包括间充质干细胞的细胞培养物；4）将所述间充质干细胞或包括间充质干细胞的细胞培养物置于所述间充质干细胞扩增培养基中进行传代培养，同时保持间充质干细胞的特性。
[0010]进一步，其中所述步骤2）进行4
‑
8天，例如6天。
[0011]进一步，其中所述步骤3）包括：所述滋养层干细胞或包括滋养层干细胞的细胞培养物分化培养5
‑
7天（例如5天）得到P1代细胞，P1代细胞继续分化培养6
‑
9天（例如7天）得到所述间充质干细胞或包括间充质干细胞的细胞培养物。
[0012]进一步，所述步骤4）包括：所述P1代细胞传代培养得到P2代细胞，所述P2代细胞传代培养至P3代细胞，所述P3代细胞传代培养至P4代细胞，所述P4代细胞继续进行后续传代培养，每3天传代一次。
[0013]进一步，所述滋养层干细胞分化培养基包括基础培养基、2
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mercaptoethanol（2
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巯基乙醇）、KSR（KnockOut
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血清替代物）、ITS
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X supplement（ITS
‑
X补充剂）、L
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AA
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pi、EGF（表皮细胞生长因子）、GSK3β受体抑制剂CHIR99021、ALK4/5/7抑制剂A83
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01、ALK5抑制剂SB431542、VPA（丙戊酸）、ROCK抑制剂 Y27632和BMP4。
[0014]更进一步，所述滋养层干细胞分化培养基包括基础培养基、0.1 mM 2
‑
mercaptoethanol（2
‑
巯基乙醇）、20% KSR（KnockOut
™ꢀ
血清替代物）、1% ITS
‑
X supplement（ITS
‑
X补充剂）、1.5 μg/ml L
‑
AA
‑
pi、50 ng/ml EGF（表皮细胞生长因子）、2 μM CHIR99021、0.5 μM A83
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01、1 μM SB431542、0.8 mM VPA（丙戊酸）、5 μM Y27632和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：步骤1）提供扩展多潜能干细胞或包括扩展多潜能干细胞的细胞培养物；步骤2）将所述扩展多潜能干细胞或包括扩展多潜能干细胞的细胞培养物置于滋养层干细胞分化培养基中培养，得到滋养层干细胞或包括滋养层干细胞的细胞培养物；步骤3）将所述滋养层干细胞或包括滋养层干细胞的细胞培养物置于间充质干细胞分化培养基中培养，得到间充质干细胞或包括间充质干细胞的细胞培养物；步骤4）将所述间充质干细胞或包括间充质干细胞的细胞培养物置于所述间充质干细胞扩增培养基中进行传代培养，同时保持间充质干细胞的特性。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）进行4
‑
8天。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2）进行6天。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）包括：所述滋养层干细胞或包括滋养层干细胞的细胞培养物分化培养5
‑
7天得到P1代细胞，所述P1代细胞继续分化培养6
‑
9天得到所述间充质干细胞或包括间充质干细胞的细胞培养物。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3）包括：所述滋养层干细胞或包括滋养层干细胞的细胞培养物分化培养5天得到P1代细胞，所述P1代细胞继续分化培养7天得到所述间充质干细胞或包括间充质干细胞的细胞培养物。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤4）包括：所述P1代细胞传代培养得到P2代细胞，所述P2代细胞传代培养至P3代细胞，所述P3代细胞传代培养至P4代细胞，所述P4代细胞继续进行后续传代培养，每3天传代一次。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述滋养层干细胞分化培养基包括基础培养基、2
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巯基乙醇、KnockOut
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血清替代物、ITS
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X补充剂、L
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AA
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pi、表皮细胞生长因子、GSK3β受体抑制剂CHIR99021、ALK4/5/7抑制剂A83
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01、ALK5抑制剂SB431542、丙戊酸、ROCK抑制剂Y27632和BMP4。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述滋养层干细胞分化培养基包括基础培养基、0.1 mM 2
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巯基乙醇、20% KnockOut
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血清替代物、1% ITS
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X补充剂、1.5 μg/ml L
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AA
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pi、50 ng/ml 表皮细胞生长因子、2 μM CHIR99021、0.5 μM A83
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01、1 μM SB431542、0.8 mM 丙戊酸、5 μM Y27632和10 ng/mL BMP4；所述基础培养基是RKO
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E6培养基或者是由DME...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚士欣，顾雨春，李楠，彭钦清，吴理达，
申请(专利权)人：呈诺再生医学科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：