本发明专利技术公开了一种石爬鮡肝脏细胞分离、培养和冷冻保存方法，适用于生物工程技术领域，选健康石爬鮡进行解剖，无菌条件下取出肝脏于HM培养基中，清洗三次后切成块状，胰蛋白酶消化后经细胞筛过滤获得细胞悬液，显微镜下计数后，以一定浓度接种到24孔细胞培养板中，加入DM培养基进行培养；随后，采用冷冻保存剂对培养的肝脏细胞进行液氮冻存，得到石爬鮡肝脏细胞最佳保存体系。本发明专利技术采用的石爬鮡肝脏细胞培养方法可重复性强，效果佳；本发明专利技术建立了稳定的肝脏细胞原代培养体系，使用特殊的培养基，提高了所提取肝脏原代培养细胞的活力，为进一步开展石爬鮡肝脏功能研究提供细胞模型，并且对石爬鮡的保育具有重要的现实意义。并且对石爬鮡的保育具有重要的现实意义。
【技术实现步骤摘要】
一种石爬鮡肝脏细胞分离、培养和冷冻保存方法
[0001]本专利技术公开了一种石爬鮡肝脏细胞分离、培养和冷冻保存方法，适用于生物工程
技术介绍
[0002]肝脏是鱼类体内最大的消化腺，具有胆汁合成、脂类代谢、糖代谢、激素代谢以及解毒功能。近年来我国的集约化水产养殖业发展迅猛，与此同时也暴露出一个严峻的问题：生产中经常出现强化投饲、滥施药物、饲料营养组成不平衡以及添加变质或禁用物质等诸多问题，造成水产动物病害频繁发生，其中以损伤肝脏和诱发肝脏病变为特征的疾病危害最大。因为肝脏是鱼体内最主要的代谢器官，其损伤或者病变往往导致水产动物机体代谢机能紊乱和抗病力降低，极易造成继发传染性疾病的爆发和综合症的肆虐，严重威胁着集约化水产养殖业的持续健康发展。鱼类肝脏病变中最常见的表现形式是脂肪肝，尤以营养性脂肪肝危害最突出，已经引起水产科技工作者和养殖者的广泛关注。
技术实现思路
[0003]本专利技术的目的在于提供了一种石爬鮡肝脏细胞分离、培养和冷冻保存方法，方法简单，利用申请人提供的适用于石爬鮡肝脏细胞原代培养的培养液及肝脏细胞的分离方法，可获得数量多，纯度高，活力稳定的肝脏培养细胞。
[0004]本专利技术依照石爬鮡的生理特性，专门配制了适用于石爬鮡肝脏细胞培养的培养液，并且对肝脏细胞的分离过程进行了改进，能够获得大量且活力稳定的肝脏原代培养细胞。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
[0006]一种石爬鮡肝脏细胞分离、培养和冷冻保存方法，包括下述步骤：<br/>[0007](1)用HM培养基将健康石爬鮡的新鲜肝脏0.1
‑
1.0mm的组织块清洗干净；
[0008]以上所述的方案，优选的，所述的组织块是先使用HM培养基对健康石爬鮡的新鲜肝脏组织进行清洗后再将清洗干净的肝脏组织切成0.1
‑
1.0mm的组织块；
[0009](2)向组织块中加入含有0.1
‑
1mM EDTA的HM培养基，轻轻摇动混匀后静置至组织块沉于底部，吸除培养基；
[0010](3)向组织块中加入含100
‑
1000unit/ml Collagenase IV和0.01
‑
0.1mg/ml DNase II的HM培养基，28℃水浴消解15
‑
60分钟；
[0011](4)移除含Collagenase IV和DNase II的HM培养基，加入HM培养基，使用移液管吹打，将肝细胞吹散；
[0012](5)利用22
‑
100μM孔径滤网将未吹散的细胞过滤分离除去，收集打散分离的细胞；
[0013](6)200
‑
1000rpm 4℃离心5
‑
10min收集肝脏细胞，使用吸管移除上清培养基，加入10
‑
50ml DM培养基重悬细胞；
[0014](7)吸取10
‑
50μl细胞悬液，加入10
‑
100μl台酚蓝染色细胞，然后显微镜下计数细
胞；
[0015](8)使用DM培养基将细胞稀释至1.0
‑
5.0
×
106cells/ml，向直径35mm的培养盘中接种1.0
‑
5.0
×
106细胞，28℃，5％ CO2培养箱中培养细胞6
‑
36小时；
[0016](9)使用冷冻保存剂将密度为2.0
×
106cells/ml的石爬鮡细胞进行梯度降温后，冻存于液氮中保存。
[0017]进一步地，所述的HM培养基的配方包括：
[0018]KCl:1.0
‑
1.0mg/ml,K2HPO4:0.01
‑
0.1mg/ml；NaCl:1.0
‑
10.0mg/ml；NaH2PO4:0.01
‑
0.1mg/ml；Glucose:1.0
‑
10.0mg/ml；HEPES:1.0
‑
10.0mg/ml；NaHCO3:0.1
‑
1.0mg/ml；青霉素:50
‑
100U/ml，链霉素：50
‑
100μg/ml。
[0019]再进一步地，所述的DM培养基和冷冻保存剂的配方包括：
[0020]DMEM/F
‑
12:1.0
‑
10.0mg/ml；NaHCO3:1.0
‑
10.0mg/ml；BSA:1.0
‑
10.0mg/ml；青霉素:50
‑
100U/ml，链霉素：50
‑
100μg/ml。
[0021]冷冻保存剂：DMSO浓度为10％，血清浓度为90％。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0023]1.本专利技术探索出一种适合石爬鮡肝脏细胞分离、培养和冷冻保存方法，获得了数量多、纯度高的石爬鮡肝脏细胞；运用依据石爬鮡肝脏细胞特性配制的培养基，提高了所提取肝脏培养细胞的活力，为进一步开展石爬鮡肝脏功能研究提供细胞模型，并且对石爬鮡的保育具有重要的现实意义。。
[0024]2.本专利技术所用到的培养基均采用自有的配方配制，不仅可以提高石爬鮡肝脏细胞的活力，而且成本得到了很好的控制，可以满足大批量培养。
附图说明
[0025]图1为石爬鮡肝脏细胞图
[0026]图2为NKB(1μM)，IGF
‑
1(0.1μM)，EGF(0.1μM)和SLα(0.1μM)对石爬鮡肝脏培养细胞中β
‑
actin和GHR mRNA表达量影响示意图。
具体实施方式
[0027]本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
[0028]实施例1
[0029]一种石爬鮡肝脏细胞分离、培养和冷冻保存方法，包括下述步骤：
[0030](1)使用HM培养基对健康石爬鮡的新鲜肝脏组织进行清洗；
[0031](2)将3g清洗干净的肝脏组织切成0.5mm的组织块；
[0032](3)将切碎的组织块转移至50ml离心管中，使用HM培养基对其清洗三次；
[0033](4)向组织块中加入含有1mM EDTA的HM培养基30ml，轻轻摇动混匀后静置至组织块沉于底部，使用吸管吸除培养基；
[0034](5)向组织块中加入30ml HM培养基(含500unit/ml Collagenase IV和0.01mg/ml DNase I)，28℃水浴消解30分钟；
[0035](6)移液管移除含Collagenase IV和DNase II的HM培养基，加入20ml新的HM培养
基，使用2ml移液管吹打3本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种石爬鮡肝脏细胞分离、培养和冷冻保存方法，其特征在于：包括下述步骤：(1)用HM培养基将健康石爬鮡的新鲜肝脏0.1
‑
1.0mm的组织块清洗干净；(2)向组织块中加入含有0.1
‑
1mM EDTA的HM培养基，轻轻摇动混匀后静置至组织块沉于底部，吸除培养基；(3)向组织块中加入含100
‑
1000unit/ml Collagenase IV和0.01
‑
0.1mg/ml DNase II的HM培养基，28℃水浴消解15
‑
60分钟；(4)移除含Collagenase IV和DNase II的HM培养基，加入HM培养基，使用移液管吹打，将肝细胞吹散；(5)利用22
‑
100μM孔径滤网将未吹散的细胞过滤分离除去，收集打散分离的细胞；(6)200
‑
1000rpm 4℃离心5
‑
10min收集肝脏细胞，使用吸管移除上清培养基，加入10
‑
50ml DM培养基重悬细胞；(7)吸取10
‑
50μl细胞悬液，加入10
‑
100μl台酚蓝染色细胞，然后显微镜下计数细胞；(8)使用DM培养基将细胞稀释至1.0
‑
5.0
×
106cells/ml，向直径35mm的培养盘中接种1.0
‑
5.0
×
106细胞，28℃，5％CO2培养箱中培养细胞6
‑
36小时；(9)使用冷冻保存剂将密度为2.0
×
106cells/ml的石爬鮡细胞进行...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘强，朱岳钢，杜光远，呼光富，熊皓，周小云，杨瑞斌，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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