诱导性成熟肝脏细胞及其制备的方法技术

本发明专利技术涉及用于制备并诱导产生诱导性成熟肝脏细胞的组合物，制备诱导性成熟肝脏细胞的方法，以及产生的诱导性成熟肝脏细胞。以及产生的诱导性成熟肝脏细胞。以及产生的诱导性成熟肝脏细胞。

【技术实现步骤摘要】
诱导性成熟肝脏细胞及其制备的方法


[0001]本专利技术涉及用于制备并诱导产生诱导性成熟肝脏细胞的组合物，制备诱导性成熟肝脏细胞的方法，以及诱导产生的诱导性成熟肝脏细胞。

技术介绍

[0002]原代肝脏细胞在肝脏疾病的科学研究和临床治疗中发挥着重要的作用。例如，肝脏细胞可以通过疾病模型的构建用于发病机制的研究和相关药物的筛选；肝脏细胞的移植可以治疗慢性肝脏疾病和缓解晚期肝衰竭等。目前，原代肝脏细胞主要的获取方式是从供肝中分离细胞，但是由于供肝数量有限和原代肝脏细胞在体外较难培养等因素，肝脏细胞资源的获取给科研和临床中的应用带来了严重阻碍。
[0003]诱导性肝脏细胞的出现为解决这个瓶颈带来了巨大的希望。在2003年，Melissa K.Carpenter课题组率先在体外成功地将人源胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)分化为表达肝脏标记基因的诱导性肝脏细胞(Lakshmi Rambhatla，2003b Generation of Hepatocyte
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Like Cells From Human Embryonic Stem Cells.Cell Transplantation，12，1
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11.)。随着人源诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)的出现，利用诱导性多能干细胞诱导肝脏细胞的方法也很快被构建出来(Song et al.，2009 Efficient generation of hepatocyte
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like cells from human induced pluripotent stem cells.Cell Res 19，1233
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1242.10.1038/cr.2009.107.；Takahashi et al.，2007 Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell 131，861
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872.10.1016/j.cell.2007.11.019.)。此外，还有研究通过转分化的方式将成纤维细胞直接诱导为肝脏细胞(Du et al.，2014 Human hepatocytes with drug metabolic function induced from fibroblasts by lineage reprogramming.Cell Stem Cell 14,394
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403.10.1016/j.stem.2014.01.008；Huang et al.,2014 Direct reprogramming of human fibroblasts to functional and expandable hepatocytes.Cell Stem Cell 14,370
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384.10.1016/j.stem.2014.01.003.；Zhu et al.,2014 Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts.Nature 508,93
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97.10.1038/nature13020.)
[0004]近年来，虽然体外诱导肝脏细胞的技术在不断更新和完善，但是目前得到的诱导肝脏细胞只获得了原代肝脏细胞的部分特征，这类诱导肝脏细胞更类似于胎肝细胞而不是成熟的原代肝脏细胞(Baxteretal.,2015 Phenotypic and functional analyses show stem cell
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derived hepatocyte
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like cells better mimic fetal rather than adult hepatocytes.J Hepatol 62,581
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589.10.1016/j.jhep.2014.10.016.)。
[0005]从形态上来看，人源原代肝脏细胞相对比较立体，细胞中呈现出清晰的细胞核，部分细胞呈双核，细胞核比较小且核质比相对较低。而现有技术中诱导的肝脏细胞虽然呈肝脏细胞所特有的多角形，但是细胞相对贴壁而不立体，细胞中基本看不到清晰的细胞核，含有双核的细胞极少，核质比也远大于原代肝脏细胞。
[0006]在基因表达方面，现有技术诱导的肝脏细胞中一系列与肝脏代谢相关的重要蛋白酶都没有显著表达，例如CYP3A4，CYP2C9等。
[0007]在功能方面，现有技术中诱导的肝脏细胞虽然具有白蛋白分泌能力，但是每24小时每百万个细胞的分泌量在2
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5μg左右，而高质量原代肝脏细胞的分泌能力可以达到10μg以上(Zhu etal.,2014Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts.Nature 508,93
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97.10.1038/nature13020.)。此外，现有技术中诱导肝脏代谢的CYP450代谢能力和尿素合成的能力也与原代肝脏细胞相差较远。另外，现有技术中的诱导性肝脏细胞仍然缺失肝脏极性；在体内重建方面，当将现有技术中的诱导性肝脏细胞移植到慢性肝脏损伤的小鼠模型体内时，血液中检测到人源白蛋白所需要的时间相对较长，且血液中检测到的白蛋白最高的浓度仅有约几百纳克每毫升，这说明白蛋白分泌能力较低，同时诱导性肝脏细胞在体内的重建率不到1％。而原代肝脏细胞在慢性肝脏损伤小鼠体内白蛋白的分泌能力可以达到1mg/ml以上，体内重建效率可以达到90％以上(Zhang et al.，2018 In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity.Cell Stem Cell 23，806
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819e804.10.1016/j.stem.2018.10.018.)。此外，在慢性肝损小鼠体内嵌合的诱导性肝脏细胞因为不能迁移而主要在肝门静脉附近发生嵌合(Wang et a).，2019 Human ESC
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derived expandable hepatic organoids enable therapeutic liver repopulation and pathophysiological modeling of alcoholic liver injury.Cell Res 29，1009
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1026.10.1038/s41422
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019
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0242
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8.；Yan e本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种第一组合物，其包含：(a)HDAC抑制剂；(b)类固醇类化合物；(c)Notch信号通路抑制剂；(d)MEK抑制剂；以及(e)TGF
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beta信号通路抑制剂；优选地，所述第一组合物进一步包含(f)p38 MAPK抑制剂。2.一种第一试剂盒，其包含：(a)HDAC抑制剂；(b)类固醇类化合物；(c)Notch信号通路抑制剂；(d)MEK抑制剂；(e)TGF
‑
beta信号通路抑制剂；以及相应的使用说明；优选地，所述第一试剂盒进一步包含(f)p38 MAPK抑制剂。3.一种第一培养基，其包含：(a)HDAC抑制剂；(b)类固醇类化合物；(c)Notch信号通路抑制剂；(d)MEK抑制剂；(e)TGF
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beta信号通路抑制剂；以及基础培养基，优选地所述基础培养基选自DMEM、Knockout DMEM、RPMI 1640、DMEM/F12、HCM和William
’
E等培养基；优选地，所述第一试剂盒进一步包含(f)p38 MAPK抑制剂。4.一种第二组合物，其包含：(a)cAMP激活剂；(b)ROCK抑制剂；(c)类固醇类化合物以及(d)TGF
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beta信号通路抑制剂。5.一种第二试剂盒，其包含：(a)cAMP激活剂；(b)ROCK抑制剂；(c)类固醇类化合物；(d)TGF
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beta信号通路抑制剂；以及相应的使用说明。6.一种第二培养基，其包含：(a)cAMP激活剂；(b)ROCK抑制剂；(c)类固醇类化合物；(d)TGF
‑
beta信号通路抑制剂；以及基础培养基，优选地所述基础培养基选自DMEM、Knockout DMEM、RPMI 1640、DMEM/F12、HCM和William
’
E等培养基。7.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的组合物、试剂盒或培养基，其中所述HDAC抑制剂选自Mocetinostat(MGCD0103)、Abexinostat(PCI
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24781)、Fimepinostat(CUDC
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907)、ITSA
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1、Vorinostat(SAHA)、MS
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275、Panobinostat(LBH589)、Quisinostat、FK228、SB939、Trichostatin A(TSA)等；优选地，所述HDAC抑制剂是MS
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275。8.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的组合物、试剂盒或培养基，其中所述类固醇类化合物选自泼尼松、甲泼尼松、倍他米松、丙酸倍氯米松、泼尼松龙、氢化可的松、地塞米松等；优选地，所述类固醇类化合物是地塞米松。9.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的组合物、试剂盒或培养基，其中所述Notch信号通路抑制剂选自IMR
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1、RO4929097、Semagacestat(LY450139)、Avagacestat(BMS
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708163)、Dibenzazepine(YO
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01027)、Crenigacestat(LY3039478)、Compound E、DAPT等；优选地，所述Notch信号通路抑制剂是Compound E。10.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的组合物、试剂盒或培养基，其中所述MEK抑制剂选自SeluMetinib(AZD6244)、Trametinib(GSK1120212)、PD0325901、U0126、U0126
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ETOH、PD184352(CI
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1040)等；优选地，所述MEK抑制剂是PD0325901。11.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的组合物、试剂盒或培养基，其中所述TGF
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beta信号通路抑制剂选自SD
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208、LY2109761、BIBF
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0775、A83
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01、SB431542等；优选地，所述TGF
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beta信号通路抑制剂是A83
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01。12.根据权利要求1
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3中任一项所述的组合物、试剂盒或培养基，其中所述p38 MAPK抑制剂选自SB202190(FHPI)、SB203580、TAK
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715、Doramapimod(BIRB 796)等；优选地，所述p38 MAPK抑制剂是SB203580。13.根据权利要求4
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6中任一项所述的组合物、试剂盒或培养基，其中所述cAMP激活剂选自Forskolin、8
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Br
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cAMP等；优选地，所述cAMP激活剂是Fors...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁胜，郝婕，马天骅，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：