一种皮肤组织单细胞测序中高质量细胞悬液制备的方法技术

本发明专利技术公开了一种皮肤组织单细胞测序中高质量细胞悬液制备的方法，S1.在离心管中用DMEM配制4ml酶A和混合酶B，其中，酶A含胰蛋白酶，酶B含胶原蛋白酶Ⅰ、胶原蛋白酶Ⅱ、胶原蛋白酶Ⅳ、胶原蛋白酶V、中性蛋白酶、透明质酸酶和DNAse I；S2.将皮肤组织转移至加入DMEM培养基的培养皿中，用显微剪将皮肤外的脂肪等非目标组织剔除干净；将清洗后的皮肤组织剪切成约2mm直径大小的组织块，PBS清洗1

【技术实现步骤摘要】
一种皮肤组织单细胞测序中高质量细胞悬液制备的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体为一种皮肤组织单细胞测序中高质量细胞悬液制备的方法。

技术介绍

[0002]皮肤作为人体最大的器官，是人体的第一道生理防线。皮肤由最外层的表皮层和表皮下的真皮层组成，表皮层在身体表面形成保护屏障，防止病原体进入，使机体免受病原微生物侵袭；真皮层由结缔组织组成，可以缓冲身体压力，使体内组织器官免受机械性、物理性等伤害。皮肤科疾病种类繁杂，对皮肤细胞异质性的研究为更深层理解皮肤发育和疾病发生机制、抵抗皮肤衰老、对皮肤疾病精准诊断和治疗等提供了更多可能。单细胞测序技术在单个细胞层面对基因组、转录组、表观基因组、蛋白组等进行研究，在神经、发育、免疫、肿瘤等多个领域广泛应用。皮肤组织的单细胞研究可以应用于皮肤细胞异质性及细胞亚群鉴定、皮肤发育、自身免疫性皮肤病、皮肤感染、伤口愈合、皮肤肿瘤等多个方面。但皮肤样本制备困难，样本解离时细胞活性、转录组完整性容易发生变化，这些成为目前皮肤样本进行单细胞测序的限制因素。
[0003]高质量的单细胞悬液制备是进行后续文库构建和测序的关键。皮肤的表皮和真皮紧密结合，其中，表皮层主要是紧密排列的角质层细胞，也包含黑色素细胞等；真皮层由致密的结缔组织构成，主要由多种纤维细胞组成，此外真皮层还存在毛囊、汗腺、神经、血管等。基于皮肤的组成和结构，研发了皮肤组织消化解离制备单细胞悬液的方案。采用本专利技术消化解离皮肤组织，实验结果发现制备的单细胞样本质量符合单细胞测序的要求。因此，在本技术的基础上可以拓展对皮肤单细胞研究的层面，广泛应用于单细胞测序领域以及生物医疗领域。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种皮肤组织单细胞测序中高质量细胞悬液制备的方法，具有总量多、活率高、有核率高，结团率低的优点。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种皮肤组织单细胞测序中高质量细胞悬液制备的方法。
[0006]S1.在离心管中用DMEM配制4ml酶A和混合酶B，其中，酶A含胰蛋白酶，酶B含胶原蛋白酶Ⅰ、胶原蛋白酶Ⅱ、胶原蛋白酶Ⅳ、胶原蛋白酶V、中性蛋白酶、透明质酸酶和DNAse I；
[0007]S2.将皮肤组织转移至加入DMEM培养基的培养皿中，用显微剪将皮肤外的脂肪等非目标组织剔除干净；
[0008]将清洗后的皮肤组织剪切成约2mm直径大小的组织块，PBS清洗1
‑
2次。
[0009]S3.吸取皮肤组织颗粒至配制好的酶A中，置于恒温水浴震荡仪中37℃120rpm孵育并消化15
‑
90分钟直至细胞数目满足收集要求，其间每隔10分钟用移液器吹打8次，将收集的细胞过70μm细胞筛后将酶液离心富集细胞，用含1％ FBS的培养基重悬细胞，置冰备用；
[0010]S4.将酶A消化后的剩余组织中加入酶B，轻轻吹打悬浮后置于恒温水浴震荡仪中37℃120rpm孵育并消化15
‑
25分钟直至细胞数目满足收集要求，期间用枪头吹打8次；
[0011]S5.将S3和S4中收集的细胞合并，依次过70μm和30μm细胞筛，8℃500gg离心5分钟，弃上清获取细胞沉淀；
[0012]S6.用PBS缓冲液或培养基重悬细胞沉淀后计数，判断细胞质量，如果有小碎片可用5％FBS清洗一次。
[0013]优选的，酶B中胶原蛋白酶Ⅰ的终浓度为0.8
‑
1mg/ml；
[0014]胶原蛋白酶Ⅱ的终浓度为0.8
‑
1mg/ml；
[0015]胶原蛋白酶Ⅳ的终浓度为1
‑
2mg/ml；
[0016]胶原蛋白酶V的终浓度为1.5
‑
2mg/ml；
[0017]中性蛋白酶的终浓度为0.8mg/ml；
[0018]透明质酸酶的终浓度为80U/mL；
[0019]DNAse I的终浓度为0.1mg/ml。
[0020]优选的，在S3和S4中，孵育至10
‑
15分钟期间，观察其中酶液浑浊情况和组织情况，如有大量絮状结团，则加入DNase至0.8mg/ml后继续孵育。
[0021]优选的，S3中，脸部，头部以上皮肤组织消化时长40～45分钟；
[0022]头部以下皮肤组织消化时长60～90分钟。
[0023]优选的，S4中，孵育的第10分钟时取上清液计数，如细胞数目满足收集需求，继续消化5分钟后收集细胞；
[0024]如细胞数目不满足收集需求，需继续消化10
‑
15分钟后收集细胞，其间吹打8次。
[0025]优选的，所述S3中的培养基为RPMI
‑
1640培养基或高糖型DMEM培养基。
[0026]优选的，其用于实现皮肤单细胞的富集。
[0027]优选的，其在单细胞测序，原代细胞培养，CAT治疗中的应用
[0028]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0029]本专利技术通过采用培养基或缓冲液对皮肤组织的清洗、酶解液对皮肤组织的消化、培养基或缓冲液对皮肤细胞悬液的清洗、培养基或缓冲液对皮肤细胞的重悬以及细胞计数和细胞质量判断，富集的皮肤单细胞具有总量多、活率高、有核率高，结团率低的特点，皮肤研究拓展了研究方向；推动了皮肤单细胞测序方面的研究；保留了皮肤组织的细胞异质性，解决了皮肤成纤维细胞不容易获取的难题，为研究皮肤发育与疾病过程中单细胞基因表达提供了新的技术助力；降低了皮肤样本研究成本，加快皮肤科疾病相关的研究。
具体实施方式
[0030]基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0031]本专利技术提供一种技术方案：一种皮肤组织单细胞测序中高质量细胞悬液制备的方法。
[0032]步骤一、酶液的配制，准备两个15ml离心管，在15ml离心管中用DMEM配制4ml酶A和混合酶B。酶A含0.25％胰蛋白酶。酶液B中，胶原蛋白酶Ⅰ的终浓度为0.8
‑
1mg/ml、胶原蛋白酶Ⅱ的终浓度为0.8
‑
1mg/ml、胶原蛋白酶Ⅳ的终浓度为1
‑
2mg/ml、胶原蛋白酶V的终浓度为
1.5
‑
2mg/ml、中性蛋白酶的终浓度为0.8mg/ml、透明质酸酶的终浓度为80U/mL、DNAse I的终浓度为0.1mg/ml
[0033]步骤二、将皮肤组织转移至加入DMEM培养基的培养皿中，用显微剪将皮肤外的脂肪等非目标组织剔除干净；将清洗后的皮肤组织剪切成约2mm直径大小的组织块，PBS清洗1
‑
2次。
[0034]步骤三、用宽口枪头或巴氏吸管吸取皮肤组织颗粒至配制好的酶A中，用封口膜封口，置于恒温水浴震荡仪中37℃120rpm孵育15分钟，观察酶液浑浊情况和组织情况。如有大量絮状结团本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种皮肤组织单细胞测序中高质量细胞悬液制备的方法，其特征在于：S1.在离心管中用DMEM配制4ml酶A和混合酶B，其中，酶A含胰蛋白酶，酶B含胶原蛋白酶Ⅰ、胶原蛋白酶Ⅱ、胶原蛋白酶Ⅳ、胶原蛋白酶V、中性蛋白酶、透明质酸酶和DNAse I；S2.将皮肤组织转移至加入DMEM培养基的培养皿中，用显微剪将皮肤外的脂肪等非目标组织剔除干净；将清洗后的皮肤组织剪切成约2mm直径大小的组织块，PBS清洗1
‑
2次；S3.吸取皮肤组织颗粒至配制好的酶A中，置于恒温水浴震荡仪中37℃120rpm孵育并消化15
‑
90分钟直至细胞数目满足收集要求，其间每隔10分钟用移液器吹打8次，将收集的细胞过70μm细胞筛后将酶液离心富集细胞，用含1％FBS的培养基重悬细胞，置冰备用；S4.将酶A消化后的剩余组织中加入酶B，轻轻吹打悬浮后置于恒温水浴震荡仪中37℃120rpm孵育并消化15
‑
25分钟直至细胞数目满足收集要求，期间用枪头吹打8次；S5.将S3和S4中收集的细胞合并，依次过70μm和30μm细胞筛，8℃500gg离心5分钟，弃上清获取细胞沉淀；S6.用PBS缓冲液或培养基重悬细胞沉淀后计数，判断细胞质量，如果有小碎片可用5％FBS清洗一次。2.根据权利要求1所述的一种皮肤组织单细胞测序中高质量细胞悬液制备的方法，其特征在于：其中，酶B中胶原蛋白酶Ⅰ的终浓度为0.8
‑
1mg/ml；胶原蛋白酶Ⅱ的终浓度为0.8
‑
1mg/ml；胶原蛋白酶Ⅳ的终浓度为1<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王国荣，潘越，张腾娇，张朝政，李东旭，
申请(专利权)人：上海新开源精准医疗有限公司，
类型：发明
国别省市：