抗甲型H1N1流感病毒特异性IgY的制备方法及其相关制剂技术

本发明专利技术公开了一种抗甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒特异性ＩｇＹ的制备方法及其相关制剂，其中先制备多种针对甲型Ｈ１Ｎ１流感的复合抗原，再用所述复合抗原对产蛋母鸡进行免疫，再取免疫蛋的蛋黄制得特异性ＩｇＹ粗提物干粉，然后对进行纯化、再滤除各种细菌病毒，然后再制成抗变异甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒特异性ＩｇＹ、抗流感继发感染细菌特异性ＩｇＹ、或抗变异甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒特异性复合ＩｇＹ。本发明专利技术还将抗变异甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒特异性ＩｇＹ纳米脂质体化，制成纳米脂质体抗变异甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒特异性ＩｇＹ，增强疗效。利用这些抗甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒特异性ＩｇＹ，可制成各种制剂，进而可从根本上预防和治疗人和动物的甲型Ｈ１Ｎ１流感；比目前使用的防治方法更方便、更经济、更安全、更有效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗体及其新型制剂，特别是涉及一种抗甲型H1N1流感病 毒特异性IgY的制备方法及其相关制剂。
技术介绍
2009年4月间首先在墨西哥爆发，然后迅速扩散到世界许多国家和地区的 流感是由一种甲型H1NA(H1N1)型流感病毒引起的。这种甲型H1N1流 感病毒是人类流感病毒，北美洲禽流感病毒，以及北美洲、欧洲和亚洲猪流感 病毒的混合体，包含了人类流感病毒、北美洲禽流感病毒，以及北美洲、欧洲 和亚洲猪流感病毒的基因成份，是发生基因突变的一种新型病毒。最令人担忧 的是，这种新型病毒已在人际间传播。根据猪和人类在血亲学上相似的特点， 说明两者的免疫源性和抗原性是相似的。这就意味着，这种新型流感病毒在人 体内会很快适应；它的流行强度会超过SARS病毒和禽流感病毒，而人类对于 这种新型病毒又没有免疫力。因此，甲型H1N1流感病毒的出现，将对人类的 生命和健康构成极大的威胁。由于甲型H1N1流感病毒和其它流感病毒一样会 在感染人类和动物的过程中不断变异，使人和动物的免疫系统对它作用下降， 达到"越战越勇"的效果；因此，阻止这种新型流感病毒流行，将是全人类面临 的一场长期的挑战。目前，对付甲型H1N1流感的方法主要有以下几种。1、接种疫苗疫苗是预防流感的有效手段，不过目前全球使用的季节性 流感疫苗对甲型H1N1流感病毒是无效的；现在中国和其它一些国家都在加紧 研制甲型H1N1疫苗，估计很快就可问世。但是，由于流感病毒的抗原性不断 漂移与变异，这种变异的新型流感病毒当然也会不断变异；而过去的经验已证 明，流感病毒往往半年就变异一次，流感疫苗的研制进展跟不上流感病毒变异 速度，因此，严重影响了流感疫苗的实际效果。因此，可以设想，将要问世的甲型H1N1疫苗如不能突破抗变异的难题，其命运也一样。另外，甲型H1N1 疫苗和其它流感疫苗一样都没有治疗作用。2、 隔离感染者这是当前世界各国普遍采用的方法。由于流感病毒的传播速度十分快，感染者在没有出现症状时已开始对外排毒；因此， 一旦发生大 流行，隔离感染者的具际作用成疑。3、 戴口罩由于甲型H1N1流感病毒和一般流感病毒一样体积很小，一 般口罩根本无法阻挡住甲型H1N1流感病毒。因此，戴口罩只是心理安慰，实 际没多大作用。4、 入境口岸体温检测由于流感病毒携带者往往并不定表现症状，更不 一定会在出入境时发烧；因此，只能偶然发现个别正在发烧的受感染者，多数 成为"漏网之鱼"。2009年4月30日从疫区墨西哥到上海的航班，机上明显有 一名甲型H1N1流感病毒携带者，在上海机场经过两小时的体温检测；但是， 这么严密的多重体温检测;却仍然未能检测到任何异常。结果该感染者到香港 后就发病了 ，成为中国境内首位确诊的甲型H1N1流感病例。5、 采用"达菲"等神经氨酸酶抑制剂试验证明，扎那米韦(Zanamivir)和奥 司他韦(Osdtamivir)等神经氨酸酶抑制剂对甲型HlNl流感病毒敏感，因此， 这类药物对甲型H1N1流感有一定的治疗作用。但是，该类药物有明显的中枢 神经系统副作用，日本已出现多起因服用"达菲"而出现神经错乱症状的病例。 而且，临床也证明，服用这类药物易出现耐药毒珠的传播；因而，限制了其在 临床上的应用。另外，这种药物也只有一定的治疗作用，根本没有预防效果。综上所叙，研发一种既能有效预防甲型H1N1流感，又可有效治疗甲型 H1N1流感的新一代药物，就成为摆在世界各国医药卫生界面前的重大课题， 也是全球公共卫生事业的迫切需求。
技术实现思路
针对现有技术的需要，本专利技术提供一种既能有效预防甲型H1N1流感、又 可有效治疗甲型H1N1流感的新一代药物。本专利技术中提供一种抗甲型H1N1流感病毒特异性IgY的制备方法，其特征 在于，包括以下步骤(51) 制备针对甲型H1N1流感的复合抗原；(52) 取所述复合抗原，对产蛋母鸡进行免疫，检取免疫的母鸡所产免疫蛋；(53) 取所述免疫蛋的蛋黄，搅拌均匀，加入蒸馏水，进行稀释并混合均 匀，再制得特异性IgY粗提物干粉；(54) 对所述粗提物干粉进行纯化、再滤除各种细菌病毒，制成抗甲型 H1N1流感病毒特异性IgY。本专利技术所述步骤(S1)中的复合抗原可包括流感病毒复合抗原，制备步骤如 下.-分别取等量禽流感疫苗液体、猪流感疫苗液体以及季节性人流感疫苗液体， 置入超速离心机，以25000rpm高速离心，取上清；以常规硫酸铵沉淀法沉淀 病毒颗粒，再置入超速离心机，以25000rpm高速离心，取沉淀；用Sepharose 4B分离，分别收集禽流感病毒、猪流感病毒以及季节性人流感病毒颗粒；用 蔗糖密度梯度超速离心法纯化三种流感病毒，具体是分别取上述粗提的三种流 感病毒悬浮液l.Oml,轻轻加到40%和60%不连续密度梯度的蔗糖液上面，经 100,000g离心2小时，取蔗糖层中间区带液，加入pH7.2、 0.01M磷酸盐缓冲 盐水l.Oml，混匀，透析除糖，即得三种纯化的流感病毒悬浮液；将所述纯化 的禽流感病毒、猪流感病毒以及季节性人流感病毒悬浮液按111比例混合， 再置入高速搅拌机充分混合均匀，得到含三种流感病毒成份的复合流感病毒混 合液；分别取上述制备的复合流感病毒混合液加入10-15%十二烷基硫酸钠 (SDS)，裂解30分钟，得到裂解后的复合流感病毒抗原成份；按l:l的比例加 入福氏佐剂，置入高速匀浆器中，以8，000rpm高速匀化，形成油包水液体， 即制得含禽流感病毒、猪流感病毒以及季节性人流感病毒等三种流感病毒裂解 成份的流感病毒复合抗原；利用该流感病毒复合抗原，通过所述步骤(S2)、 (S3)、 (S4)，制备得到抗变 异甲型H1N1流感病毒特异性IgY。本专利技术所述步骤(S1)中的复合抗原还可包括三种流感病毒多肽HA2复合 抗原，制备步骤如下用RT-PCR方法，分别从H5N1禽流感病毒、H3N2猪 流感病毒以及季节性H1N1人流感病毒RNA克隆血凝素(HA2)基因中去掉信号肽和穿膜区的片段；先插入pGEM-T载体，测序证明所获得的基因序列正确 后，用限制性内切酶EcoRI和Notl双酶消化，电泳回收目的片段，与用同 样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接；转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，提 质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌KM71和GS115;在不含组氨酸 的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷 贝转化株；挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜，稀释后继 续培养，待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇 的培养基，继续培养24-48小时；于培养的不同时间采样，用ELISA法测定 上清中HA的表达量，选表达量最高的时间收获，离心去除细胞沉淀，上清中 即含大量表达产物；经50%硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸镏 水透析24小时，以及Sephacryl S-200和Sephacryl S-100柱层析后，即分别 获得纯化的三种流感病毒HA2抗原成份；将上述三种流感病毒HA2抗原成份 表达蛋白先按1:1:1的比例混合均匀，再按1:1比例加入福氏佐剂，置入高速 匀浆器，以8，000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制得含禽流感病毒、猪 流感病毒以及季本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒特异性ＩｇＹ的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：　（Ｓ１）制备针对甲型Ｈ１Ｎ１流感的复合抗原；　（Ｓ２）取所述复合抗原，对产蛋母鸡进行免疫，检取免疫的母鸡所产免疫蛋；　（Ｓ３）取所述免疫蛋的蛋黄 ，搅拌均匀，加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，再制得特异性ＩｇＹ粗提物干粉；　（Ｓ４）对所述粗提物干粉进行纯化、再滤除各种细菌病毒，制成抗甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒特异性ＩｇＹ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：包晟，杨荣鉴，包海威，
申请(专利权)人：深圳雅臣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]