【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种畜禽和水生动物用饲料和饲料添加剂，尤其是涉及一种纳米脂质 体抗蛇毒活性酶A2和肠道病原体特异性复合IgY以及抗蛇毒活性酶A2特异性IgY，这种蛇 毒活性酶可以是脂蛋白磷脂酶A2，也可以是磷脂酶A2，本专利技术还提供这种IgY在畜禽和水 生动物饲料和饲料添加剂中的应用。
技术介绍
目前中国养殖业存在的问题(1)、饲料转化率不高畜禽和水生动物体内分泌的一种蛇毒活性酶A2 (包括脂蛋 白磷脂酶A2和磷脂酶A2)，这些酶相当于人体内的“蛔虫”，会阻止消化系统对营养成份的 吸收，造成饲料转化率不高；既制约了养殖企业的运营效率，又造成长期粮食供需矛盾，使 饲料原料价格不断攀升。(2)、传染性疾病爆发濒繁秋冬季腹泻成为流行病，蓝耳病、口蹄疫等高致病性疾 病经常造成猪群、牛群大面积死亡而产生灾难性后果，鱼虾的传染病爆发也不时给水产养 殖场带来毁灭性打击；从而，严重影响养殖业的经济效益。(3)、滥用抗生素和抗病毒化学药由于抗生素是广谱杀菌，它在杀灭动物体内的 有害菌的同时，也杀灭了其中的有益菌，这就破壤了肠道菌群平衡，降低了肠道免疫力。而 现有的抗病毒药，只是某一种药对某一种病毒复制过程的某个阶段产生一定程度的干扰或 影响而已，对已进入细胞内的病毒则毫无作用。严酷的现实是迄今为止，不会伤害宿主细 胞，又能灭活病毒真正意义上的抗病毒药在全世界尚未研制成功。欧盟已从2006年开始禁 止在饲料中添加抗生素，中国农业部则于2005年对畜禽抗病毒西药全面禁止使用。养殖企 业迫切需要不会破坏菌群平衡又无残留的抗菌药和确切有效的抗病毒药。(4)、教槽料中普遍使用血浆蛋...
【技术保护点】
一种纳米脂质体化的抗蛇毒活性酶Ａ２和肠道病原体特异性复合ＩｇＹ的制备方法，它可以是抗脂蛋白磷脂酶Ａ２和肠道病原体特异性复合ＩｇＹ，其特征在于包括以下步骤： （１）采用基因工程技术重组脂蛋白磷脂酶Ａ２表达蛋白， 首先用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆脂蛋白磷脂酶Ａ２的成熟肽编码区基因； 然后将脂蛋白磷脂酶Ａ２基因从真核表达载体ｐＣＧＮ－ＰＬＤ１亚克隆至带有绿色荧光标记蛋白的穿梭质粒ｐＡｄＴｒａｃｋ－ＣＭＶ中； 再与腺病毒骨架载体一起在大肠杆菌ＢＪ５１８３中进行同源重组，阳性重组子经燥机干燥，即制得各种抗脂蛋白磷脂酶Ａ２和肠道病原体特异性复合ＩｇＹ干粉； 再将所得干粉加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在１－１００ｎｍ之间、粒度≥１５０００目的超微粒子，制得相应的纳米化抗脂蛋白磷脂酶Ａ２和肠道病原体特异性复合ＩｇＹ或ＩｇＹ干粉； （７）把纳米化抗脂蛋白磷脂酶Ａ２和肠道病原体特异性复合ＩｇＹ制成脂质体液晶微囊， 把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，再将任意一种纳米化抗脂蛋白磷脂酶Ａ２和畜禽水生动物肠道病原体特异性复合ＩｇＹ加入４ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液配成ＩｇＹ溶液，以每处理０．５ｍｉｎ间歇０．５...
【技术特征摘要】
一种纳米脂质体化的抗蛇毒活性酶A2和肠道病原体特异性复合IgY的制备方法，它可以是抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY，其特征在于包括以下步骤(1)采用基因工程技术重组脂蛋白磷脂酶A2表达蛋白，首先用RT PCR方法克隆脂蛋白磷脂酶A2的成熟肽编码区基因；然后将脂蛋白磷脂酶A2基因从真核表达载体pCGN PLD1亚克隆至带有绿色荧光标记蛋白的穿梭质粒pAdTrack CMV中；再与腺病毒骨架载体一起在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，阳性重组子经Pac I线性化后，转染入病毒组装细胞系293细胞，构建专一性的脂蛋白磷脂酶A2重组腺病毒表达蛋白，并用该病毒颗粒感染嗜铬细胞瘤细胞PC12细胞，高效表达脂蛋白磷脂酶A2重组腺病毒表达蛋白；把已被鉴定的脂蛋白磷脂酶A2重组腺病毒表达蛋白用氯化铯梯度离心纯化，再在QBI 293A细胞中进行大量扩增；(2)制备畜禽和水生动物肠道主要病原体复合抗原首先筛选引致畜禽和水生动物肠道感染性疾病的主要病原体，并进行分类组合；再分别制备相应的各种复合抗原；(3)制备含抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY的免疫蛋选择具有高免疫应答能力的正在产蛋的无特定病原体携带的健康产蛋禽，分别采用制备的各种复合抗原在皮下注射，在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记；(4)制备抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY粗品，首先将不同抗原分别免疫的禽所产高免疫蛋用0.5％新洁而灭溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15 30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4 8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/L的NaOH溶液或者1mol/L的HCL溶液调节PH至5.5～6.0，4～6℃下静置8小时左右，稀释液通过8000 12000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩；然后，采用除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置，彻底滤除各种细菌病毒，以确保所制备的IgY绝不含任何病毒和细菌；将制得的不同的抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY，进一步组合成更多种不同的抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY；(5)抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY纯品制备，将所制得的各种抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY粗品分别过离子交换柱和凝胶交换柱进行纯化，即得相应的复合纯IgY；(6)抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY纳米化，首先取所制成的各种抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY浓缩液用冷冻干燥机干燥，即制得各种抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY干粉；再将所得干粉加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1 100nm之间、粒度≥15000目的超微粒子，制得相应的纳米化抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY或IgY干粉；(7)把纳米化抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY制成脂质体液晶微囊，把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，再将任意一种纳米化抗脂蛋白磷脂酶A2和畜禽水生动物肠道病原体特异性复合IgY加入4mmol/L磷酸盐缓冲液配成IgY溶液，以每处理0.5min间歇0.5min的方式超声处理2min，立即在水浴中减压旋转蒸发至凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而35000r/min超速离心30min以分离除去未包入的IgY，沉淀后用水洗二次，离心，得沉淀，用10mmol/L的磷酸盐缓冲液稀释，即制得纳米脂质体化的抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY。2. —种纳米脂质体化的抗蛇毒活性酶A2特异性IgY的制备方法，它可以是抗脂蛋白磷 脂酶A2特异性IgY，其特征在于包括以下步骤(1)采用基因工程技术重组脂蛋白磷脂酶A2表达蛋白，首先用RT-PCR方法克隆脂蛋白磷脂酶A2的成熟肽编码区基因；然后将脂蛋白磷脂酶A2基因从真核表达载体pCGN-PLDl亚克隆至带有绿色荧光标记 蛋白的穿梭质粒pAdTrack-CMV中；再与腺病毒骨架载体一起在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，阳性重组子经Pac I线 性化后，转染入病毒组装细胞系293细胞，构建专一性的磷脂酶A2重组腺病毒表达蛋白，并 用该病毒颗粒感染嗜铬细胞瘤细胞PC12细胞，高效表达脂蛋白磷脂酶A2重组腺病毒表达 蛋白；把已被鉴定的脂蛋白磷脂酶A2重组腺病毒表达蛋白用氯化铯梯度离心纯化，再在 QBI-293A细胞中进行大量扩增；(2)磷脂酶A2抗原制作将制得的脂蛋白磷脂酶A2表达蛋白保存液按重量比1-10 10-1的比例加入福氏佐 剂，然后置入高速勻浆机中，以30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，则制得脂蛋白 磷脂酶A2抗原；(3)制备含抗脂蛋白磷脂酶A2特异性IgY的免疫蛋选择具有高免疫应答能力的正在产蛋的无特定病原体携带的健康产蛋禽，采用制备的 脂蛋白磷脂酶A2重组表达蛋白抗原在皮下注射，在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、 方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第20 天开始拣取高免疫蛋，并进行编码标记；(4)抗脂蛋白磷脂酶A2特异性IgY粗品的制备首先将所产高免疫蛋用0. 5%新洁而灭溶液或0. 1% KMnO4溶液或其它同类消毒液将 免疫蛋浸泡15-30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛 滤除蛋清留下蛋黄加入4-8倍蒸馏水稀释搅拌均勻，用lmol/L的NaOH溶液或者lmol/L的 HCL溶液调节PH至5. 5 6. 0，4 6°C下静置8小时左右，稀释液通过8000_12000r/min 高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩；然后，采用除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置，彻底滤除各种细菌病毒，以确保所制 备的IgY绝不含任何病毒和细菌；即制得抗脂蛋白磷脂酶A2特异性IgY ；(5)抗脂蛋白磷脂酶A2特异性IgY纯品制备将所制得的抗脂蛋白磷脂酶A2特异性IgY粗品过离子交换柱和凝胶交换柱进行纯化， 即得抗脂蛋白磷脂酶A2特异性IgY纯品；(5)抗脂蛋白磷脂酶A2特异性IgY纳米化首先取所制成的抗脂蛋白磷脂酶A2特异性IgY浓缩液用冷冻干燥机干燥，即制得抗脂 蛋白磷脂酶A2特异性IgY干粉；再将所得干粉加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在I-IOOnm之间、粒度> 15000 目的超微粒子，制得相应的纳米化抗脂蛋白磷脂酶A2特异性IgY干粉；(6)把纳米化抗脂蛋白磷脂酶A2特异性IgY制成脂质体液晶微囊。把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，再将纳米化抗磷脂酶A2特异性IgY加入4mmol/L磷 酸盐缓冲液配成IgY溶液，以每处理0. 5min间歇0. 5min的方式超声处理2min，立即在水 浴中减压旋转蒸发至凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而35000r/min 超速离心30min以分离除去未包入的IgY，沉淀后用水洗二次，离心，得沉淀，用lOmmol/L的 磷酸盐缓冲液稀释，即制得纳米脂质体化的抗脂蛋白磷脂酶A2特异性IgY。3.根据权利要求1所述的一种纳米脂质体化的抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异 性复合IgY的制备方法和权利要求2所述的一种纳米脂质体化的抗脂蛋白磷脂酶A2特异 性IgY的制备方法，其特征在于所述步骤(1)的操作步骤如下(101)在培养皿中加入DMEM5%培养5X106QBI-293A细胞；(102)移去培养液，小心加入脂蛋白磷脂酶A2重组腺病毒表达蛋白混合液，十字形慢 慢晃动3次，在37°C的CO2孵箱中培养90分钟；(103)加入DMEM5% ；(104)再培养72小时，这时在IOml溶液中大约有5X109 5X 1010个脂蛋白磷脂酶 A2重组腺病毒表达蛋白颗粒；(105)进行脂蛋白磷脂酶A2重组腺病毒表达蛋白滴度测定，收集细胞，600g离心5分 钟沉淀细胞，去上清液后加入最小体积病毒保存溶液重悬细胞，-20°C /37°C冻融3次，台式 离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清液，然后进行病毒滴定；(106)-20°C/37°C冻融 3 次;(107)转入无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10分钟，收集上清液冻存 于-20°C或 _80°C ；(108)在培养瓶中加入107QBI-293A细胞进行培养；(109)将细胞裂解液上清液加入DMEM5%中，混勻，移去细胞培养液，加入混合液，十字 形慢慢晃动混勻3次，370C的CO2孵箱中培养90分钟；(110)加入DMEM5%至 30ml ；(111)再培养48 72小时，600g离心5分钟收集细胞，弃上清液，加入1/10原始体积 的溶液重悬细胞，-20°C /37°C冻融3次，台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片，收集上清 液；(112)移入50ml离心管中，台式离心机上最大速率离心10分钟，取出上清液保存；(113)在培养瓶中加入107QBI-293A细胞；(114)将细胞裂解液上清液加入DMEM5%混勻，从培养瓶中移去培养液，加入混合液感 染细胞，十字形缓慢晃动3次混勻，37°C培养90分钟；(115)加入DMEM5%至 30ml/ 瓶；(116)再培养48-72小时，进行MOI测定估计病毒滴度，用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒，则获得大量纯化的脂蛋白磷脂酶A2重组腺病毒表达蛋白保存液。4. 一种纳米脂质体化的抗蛇毒活性酶A2和肠道病原体特异性复合IgY的制备方法，它 可以是抗磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY，包括以下步骤(1)采用基因工程技术重组磷脂酶A2表达蛋白， 首先用RT-PCR方法克隆磷脂酶A2的成熟肽编码区基因；然后将磷脂酶A2基因从真核表达载体pCGN-PLDl亚克隆至带有绿色荧光标记蛋白的 穿梭质粒pAdTrack-CMV中；再与腺病毒骨架载体一起在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，阳性重组子经Pac I线 性化后，转染入病毒组装细胞系293细胞，构建专一性的磷脂酶A2重组腺病毒表达蛋白，并 用该病毒颗粒感染嗜铬细胞瘤细胞PC12细胞，高效表达磷脂酶A2重组腺病毒表达蛋白；把已被鉴定的磷脂酶A2重组腺病毒表达蛋白用氯化铯梯度离心纯化，再在QBI-293A 细胞中进行大量扩增；(2)制备畜禽和水生动物肠道主要病原体复合抗原首先筛选引致畜禽和水生动物肠道感染性疾病的主要病原体，并进行分类组合； 再分别制备相应的各种复合抗原；(3)制备含抗磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY的免疫蛋选择具有高免疫应答能力的正在产蛋的无特定病原体携带的健康产蛋禽，分别采用 制备的各种复合抗原在皮下注射，在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二 次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第20天开始拣取高 免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记；(4)制备抗磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY粗品，首先将不同抗原分别免疫的禽所产高免疫蛋用0. 5%新洁而灭溶液或0. 1% KMnO4溶 液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15-30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中 将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4-8倍蒸馏水稀释搅拌均勻，用lmol/L的 NaOH溶液或者lmol/L的HCL溶液调节PH至5. 5 6. 0，4 6°C下静置8小时左右，稀释 液通过8000-12000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩；然后，采用除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置，彻底滤除各种细菌病毒，以确保所制 备的IgY绝不含任何病毒和细菌；将制得的不同的抗磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY，进一步组合成更多种不同 的抗磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY ；(5)抗磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY纯品制备，将所制得的各种抗磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY粗品分别过离子交换柱和 凝胶交换柱进行纯化，即得相应的复合纯IgY ；(6)抗磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY纳米化，首先取所制成的各种抗磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY浓缩液用冷冻干燥机 干燥，即制得各种抗磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY干粉；再将所得干粉加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在I-IOOnm之间、粒度> 15000 目的超微粒子，制得相应的纳米化抗磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY或IgY干粉；(7)把纳米化抗磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY制成脂质体液晶微囊，把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，再将任意一种纳米化抗磷脂酶A2和畜禽水生动物肠 道病原体特异性复合IgY加入4mmol/L磷酸盐缓冲液配成IgY溶液，以每处理0. 5min间 歇0. 5min的方式超声处理2min，立即在水浴中减压旋转蒸发至凝胶状，漩涡振荡使凝胶转 相，再继续蒸发除尽乙醚，进而35000r/min超速离心30min以分离除去未包入的IgY，沉淀 后用水洗二次，离心，得沉淀，用lOmmol/L的磷酸盐缓冲液稀释，即制得纳米脂质体化的抗 磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY。5. 一种纳米脂质体化的抗蛇毒活性酶A2特异性IgY的制备方法，它可以是抗磷脂酶 A2特异性IgY，其特征在于包括以下步骤(1)采用基因工程技术重组磷脂酶A2表达蛋白，首先用RT-PCR方法克隆磷脂酶A2的成熟肽编码区基因；然后将磷脂酶A2基因从真核表达载体pCGN-PLDl亚克隆至带有绿色荧光标记蛋白的 穿梭质粒pAdTrack-CMV中；再与腺病毒骨架载体一起在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，阳性重组子经Pac I线 性化后，转染入病毒组装细胞系293细胞，构建专一性的磷脂酶A2重组腺病毒表达蛋白，并 用该病毒颗粒感染嗜铬细胞瘤细胞PC12细胞，高效表达磷脂酶A2重组腺病毒表达蛋白；把已被鉴定的磷脂酶A2重组腺病毒表达蛋白用氯化铯梯度离心纯化，再在QBI-293A 细胞中进行大量扩增；(2)磷脂酶A2抗原制作将制得的磷脂酶A2表达蛋白保存液按重量比1-10 10-1的比例加入福氏佐剂，然后 置入高速勻浆机中，以30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，则制得磷脂酶A2抗原；(3)制备含抗磷脂酶A2特异性IgY的免疫蛋选择具有高免疫应答能力的正在产蛋的无特定病原体携带的健康产蛋禽，采用制备的 磷脂酶A2重组表达蛋白抗原在皮下注射，在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注 射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第20天开始 拣取高免疫蛋，并进行编码标记；(4)抗磷脂酶A2特异性IgY粗品的制备首先将所产高免疫蛋用0. 5%新洁而灭溶液或0. 1% KMnO4溶液或其它同类消毒液将 免疫蛋浸泡15-30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛 滤除蛋清留下蛋黄加入4-8倍蒸馏水稀释搅拌均勻，用lmol/L的NaOH溶液或者lmol/L的 HCL溶液调节PH至5. 5 6. 0，4 6°C下静置8小时左右，稀释液通过8000_12000r/min 高速离心20分钟，取上清液...
【专利技术属性】
技术研发人员：包晟，杨荣鉴，汪铃，张善钧，
申请(专利权)人：深圳雅臣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]
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