本发明专利技术提供了花粉和花药绒毡层特异性启动子，其核苷酸序列如序列表ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所示。该启动子序列是通过对玉米基因组文库筛选，从玉米基因组中克隆得到的，其能驱动目的基因在花药绒毡层和花粉中具有特异性表达。本发明专利技术包括利用该启动子序列来创造雄性不育的植物基因工程方法，更具体的说，将所述启动子下游衔接异源或同源基因，并构建植物表达载体，转化宿主植物，该启动子序列能够驱动其下游基因在其花药绒毡层和花粉中高效特异表达目的蛋白，实现创造植物雄性不育，或者改造转基因植物的安全性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种从玉米中分离到的花药绒毡层和花粉特异性高效启动子序列及其应用。从玉米基因组DNA中 克隆得到的上述花药绒毡层和花粉特异性启动子，并与不同的同源、异源 基因连接构建植物表达载体，转化宿主植物，使转基因植株划分高效特异 表达其下游基因的方法和应用。
技术介绍
转基因植物研究与开发的过程中发现，外源基因表达的时间，空间和 表达量，往往是造成无法得到理想的转基因植物和有效的研究基因作用机 理的重要因素。转录水平的调控是植物基因表达调控的最重要的调控方式 在。启动子的驱动活性和特性直接决定了基因表达的时空特性以及表达量 的多少。因此，对植物启动子的克隆和功能分析非常重要。杂种优势作为一种提高作物产量，改善作物品质，提高作物抗虫、抗 病、抗逆的手段已被广泛的应用，并取得令人瞩目的成就，以植物雄性不 育为基础的杂种优势利用已成为许多作物的育种目标，在农业生产上发挥 巨大的作用。但自然出现的雄性不育类型很少存在着周期长，不育基因来 源单一等问题，而且恢复系的培育和后代的筛选上也存在着一定的不足。而利用基因工程创造雄性不育的策略为杂种优势的利用克服了上述缺陷。 主要利用花粉或花药特异表达启动子，驱动目标基因在花粉中特异表达， 获得雄性不育植株。例如Mariani等利用烟草花药绒毡层特异启动子 TA29将核糖核酸基因导入烟草，结果核糖核酸酶特异表达能够选择性地 破坏与花粉发育相关的一些器官或组织，阻断花粉发育进程，导致植物雄 性不育。 Paul等利用拟南芥花药绒站层 特异性启动子A9特异表达核糖核酸酶基因同样获得了雄性不育烟草植 株。Hird等将与抗病性相关的P-l，3葡聚糖酶基因分别与拟南芥花粉发育 早期启动子A9，A3融合，转化矮牵牛后获得不同程度的雄性不育植株 。目前对花药特异基因的转录调控还知之甚少，花药特异启动子的获得 有助于深入理解花药和花粉发育。玉米中已经获得的花药特异基因有10 余个，大多数是花粉特异，同时在花粉和花药中表达的基因很少。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一种花药绒毡层和花粉特异表达启动子序列， 来自于玉米基因组DNA，在植物花药绒毡层和花粉中特异表达。本专利技术的另 一 目的是提供一种驱动同、异源基因在花药绒毡层和花粉 中高效特异表达的新方法。本专利技术通过利用花药特异的cDNA片段，筛选玉米基因组文库，得到 的核苷酸序列，称之为pZmW7，长度为1971bp,为双链核酸类型，其序 列如序列表SEQIDNo.l所示。通过三大数据库的检索，未发现有相同或 相似性较高的序列。生物信息学分析pZm^7序列，发现其具备真核启动 子的基本元件(TATA box和CAAT box)和花药特异表达的相关顺式元 件(GC box， NTP303 Q element, LAT52 Q element)。本专利技术还提供了含有上述启动子的重组表达载体。所述启动子的下游 可连接结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因 或者能够干扰内源基因表达的小RNA,用于驱动结构基因、调节基因、 结构基因的反义基因、调节基因的反义基因、天然小RNA或人工合成的小RNA的表达。所述重组表达载体为植物重组表达载体。在一个优选的实施方式中，其表达盒是由/ Zm4W启动子和GUS (卩-葡糖醛酸酶基因)报告基因及来自胭脂碱合成酶(nos)基因的转录终止区域构成，选择标记基因为新霉素磷酸转移酶II (NPTII),所述的表达载体优选的是重组质粒pZm401::GUS。本专利技术将上述含有所述； Zm4W启动子序列的重组表达载体转化宿主细胞或宿主组织及其后代细胞，获得外源基因在花药绒毡层和花粉中高效驱动表达的基因工程化宿主细胞或宿主组织及其后代细胞。在一个优选的实施方式中，将含有所述pZm4W启动子序列驱动的表达载体转化烟草，获得了 GUS基因在花药和绒毡层中高效驱动表达的转基因植物。本专利技术所述的植物宿主细胞或宿主组织可以是植物花药绒毡层和花 粉细胞或植物药绒毡层和花粉细胞本身，或它们的后代，蛋白质等组成成 分或花药和绒毡层特性已经改变的植物花药和绒毡层细胞或植物花药和 绒毡层本身。本专利技术所述的植物组织中表达花药和绒毡层特异性启动子的方法，包 括下述步骤(1) 将含有本专利技术启动子的植物表达载体导入植物细胞；(2) 使所述的植物细胞生长成能够结种子的成熟植物。 本专利技术中所述的核酸序列还可以是还可以是所述核苷酸序列与其他启动子融合序列。本专利技术中所述的其他外源基因是指任何一段核酸序列，并具有编码某 种蛋白质或其他活性物质功能，包括RNA或DNA序列，该序列与种子 特异性启动子正常情况不相结合。此核酸序列包括不同于启动子植物种类 的异源核酸序列，以及从相同于启动子植物种类得到的同源核酸序列，但 这些序列与野生型(非转基因)植物的启动子无关。本专利技术中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在植物中进行 表达的任何一种载体，如pBI121等。本专利技术中所述的转化技术是指已知的、能够将外源基因导入植物细胞 或植物组织的任何一种植物转化方法，如农杆菌介导法等。本专利技术中所述的宿主细胞或宿主组织及后代细胞是指所有植物细胞或 植物组织或由这些细胞或组织发育成熟的整株植株(包括种子)。术语"核酸序列"指含有天然存在的碱基，糖和糖之间(支链)的键的核苷 酸或核苷酸单体的序列。该序列也包括含有发挥相似功能的非天然存在的 单体或其部分被修饰或取代的序列。术语"花药绒毡层和花粉特异性启动子"是指在启动子控制下表达的基 因在有或没有基本表达的植物花药的绒毡层和花粉中优先表达。本专利技术找到了玉米花药绒毡层和花粉特异高效表达启动子序列，并对 这一启动子的花药绒毡层和花粉高效特异活性进行了功能验证。将所述的 启动子序列连接异源或同源基因后，转化到植物中可使异源或同源基因在 植物花药绒毡层和花粉中高效特异表达，避免了目的基因在其他部位持续 表达所带的不利影响。本专利技术提供了 一种利用所述核苷酸序列驱动目的基 因在植物花药绒毡层和花粉中高效特异表达的新方法，在植物的遗传改 良，雄性不育的创造和转基因生物安全性研究方面具有重大的应用前景。附图说明图1显示的是来源于玉米的花药绒毡层和花粉特异表达启动子序列pZm4W的相关启动子元件。图2显示的是由/7Zm4W驱动的植物表达载体的构建过程。图3显示的是植物表达载体Zm401::GUS的酶切和PCR鉴定图，其 中泳道1~4依次为Sacl， i^I+Jftal，五coRI, Wal的酶切电泳，6为PCR 产物(1535f/r), 5 & 7为X/历"din+五coR I 。图4显示的是不同时期的再生烟草，其中A&B抗性芽形成，C、D&E 烟草植株再生，F转化烟草植株开花。图5显示的是部分转基因烟草植株的PCR检测结果，A: Zm^W启动 子的PCR检测，B:g^基因的PCR检测，2&17:阳性对照，3&16:阴性对照(wildtype), 1 & 18: X/历mffll+五coR I ,其他为不同转化植株。图6显示的是部分转启动子报告基因融合载体转基因烟草的Southern 杂交检测，其中1-5:不同转化植株杨蓓，6:野生型，7:质粒对照，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种花粉和花药绒毡层特异性启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：于静娟，敖光明，赵倩，刘俊起，李成霞，王冬雪，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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