一种制备凝血酶原复合物的方法技术

本发明专利技术提供一种制备凝血酶原复合物的方法，属于生物制药血液制品技术领域。具体步骤包括去冷沉淀血浆制备、阴离子交换剂吸附、洗涤、洗脱步骤，其中洗涤步骤的洗涤液中加入凝血酶抑制剂，洗脱步骤的洗脱液中不加入凝血酶抑制剂。本发明专利技术公开的凝血酶原复合物制备方法，肝素的添加量可控且添加量低，同时提供了获得无凝血酶活性、凝血因子活化水平符合《中国药典》标准的凝血酶原复合物产物的可能性。本发明专利技术公开的方法肝素损耗进一步降低，生产成本低，尤其适用于凝血酶原复合物制品的工业级放大生产。放大生产。

【技术实现步骤摘要】
intracranial hemorrhage：A review of the literature.Neurocrit Care.2010，12(3)：403
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413)。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的上述技术问题。为此，本专利技术提出了一种制备凝血酶原复合物的方法，该方法在肝素添加量可控且量低的同时，提供了获得无凝血酶活性、凝血因子活化水平符合《中国药典》标准的PCC产物的可能性，进而实现了在人凝血酶制备工艺中控制肝素物料损耗，降低生产成本的效果，具有现实的经济价值。
[0007]需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列工作和/或发现而完成的：
[0008]制备PCC最好的起始原料为去冷沉淀上清(CPS)，即去冷沉淀的血浆，其中含有绝大部分的维生素K依赖蛋白(Vitamin K dependent，VKD)成分。PCC的制备方法主要采用吸附法，当前大部分厂家选择离子交换树脂吸附剂，通过DEAE
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Sephadex A50层析制备PCC。DEAE
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Sephadex A50在洗涤洗脱过程中，因为许多血浆蛋白酶抑制物比如ATIII被去除，使得结合于DEAE
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Sephadex A50吸附剂上的凝血因子被激活，尤其是凝血因子II和凝血因子VII被激活，进而影响PCC制品的制备。按《中国药典》规定，PCC制品应无凝血因子激活(检不出FIXa、Th和蛋白酶活性)。
[0009]专利技术人意外发现，与在DEAE Sephadex A50凝胶洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中同时添加肝素以控制凝血因子活化的现有技术方案不同，只需在洗涤步骤中加入特定量的肝素也能达到相同或相近的效果。进一步地，专利技术人对肝素添加量进行了考察发现，当洗涤液中肝素添加量大于等于0.1IU/g血浆时，所得洗脱液活化的凝血因子活性、凝血酶活性符合《中国药典》PCC制品的成品标准；当肝素添加量大于0.2IU/g血浆，低于0.5IU/g血浆时，所得洗脱液活化的凝血因子活性指标没有显著提高。进一步地，专利技术人对肝素加入时序进行了考察发现，凝胶洗涤阶段肝素的添加量是影响洗脱液活化的凝血因子活性的关键因素。
[0010]为此，本专利技术提出了一种制备凝血酶原复合物的方法，包括去冷沉淀血浆制备、阴离子交换剂吸附、洗涤、洗脱步骤，其中洗涤步骤使用洗涤液进行洗涤，洗脱步骤使用洗脱液进行洗脱，在洗涤液中加入凝血酶抑制剂，在洗脱液中不加入凝血酶抑制剂。
[0011]进一步地，所述阴离子交换剂是DEAE Sephadex A50。
[0012]进一步地，所述洗涤液中加入的凝血酶抑制剂优选肝素或抗凝血酶III和肝素的混合物。
[0013]进一步地，所述洗脱液不含凝血酶抑制剂。
[0014]在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.1IU/g血浆的肝素。
[0015]在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.14IU/g血浆的肝素。
[0016]在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.16IU/g血浆的肝素。
[0017]在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.18IU/g血浆的肝素。
[0018]在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.20IU/g血浆的肝素。
[0019]在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.22IU/g血浆的肝素。
[0020]在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.24IU/g血浆的肝素。
[0021]更进一步地，所述洗涤液含有不超过0.3IU/g血浆的肝素。
[0022]更进一步地，所述洗涤液含有不超过0.35IU/g血浆的肝素。
[0023]更进一步地，所述洗涤液含有不超过0.4IU/g血浆的肝素。
[0024]更进一步地，所述洗涤液含有不超过0.45IU/g血浆的肝素。
[0025]更进一步地，所述洗涤液含有不超过0.5IU/g血浆的肝素。
[0026]根据本专利技术的实施例，当所述洗涤步骤至少反复进行2次时，至少在其中一次洗涤步骤使用含有肝素或抗凝血酶III和肝素的混合物的洗涤液进行洗涤。
[0027]优选地，当所述洗涤步骤至少反复进行2次时，在第一次洗涤步骤使用含有肝素或抗凝血酶III和肝素的混合物的洗涤液进行洗涤。
[0028]在一种具体的实施方式中，所述阴离子交换剂是DEAE Sephadex A50，所述洗涤液的洗涤体积是所述DEAE Sephadex A50平衡后凝胶体积的1
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5倍，洗涤2
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5次。
[0029]根据本专利技术实施例，所述洗涤液含有10
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30mmol/L柠檬酸钠，0.1
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0.3mol/L氯化钠，所述洗脱液含有10
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30mmol/L柠檬酸钠，0.5
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2mol/L氯化钠，pH为6.5
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7.5。
[0030]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0031]1、在PCC制品的工业级制备工艺中，本专利技术公开方法尤其使得肝素的添加量可控且添加量低，同时提供了获得无凝血酶活性、凝血因子活化水平符合《中国药典》标准的PCC产物的可能性。现有已知PCC制备工艺在洗涤洗脱液中添加肝素，不同批次PCC制品A50凝胶洗涤洗脱过程(比如凝胶用量、洗涤洗脱时间、洗涤洗脱流速等)非严格一致，而肝素的添加量与洗涤洗脱液的总体积相关，因此已知PCC制备工艺肝素总添加量在一定范围内浮动、添加量非严格可控。本专利技术公开的方法，按起始原料的重量添加肝素，与凝胶用量、洗涤洗脱时间、洗涤洗脱流速等可变量不相关，实现了肝素添加量准确控制。
[0032]2、同时专利技术人意外发现，当洗涤液中肝素添加量大于等于0.1IU/g血浆，而洗脱液不添加肝素时，所得洗脱液活化的凝血因子活性、凝血酶活性符合《中国药典》标准。与Josic等公开的3IU/mL血浆的肝素添加量相比，本专利技术工艺肝素添加量呈数量级降低。CN 106676089B公开在洗涤缓冲液洗脱缓冲液中添加200
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500IU/mL的肝素，粗略估计，1吨去冷沉淀原料血浆大约需要添加120万IU的肝素，而本专利技术工艺对应肝素添加量为20万IU肝素，肝素添加量显著降低。进一步地，与CN 106676089 B公开的工艺相比，本专利技术公开方法省去了在洗脱液中添加肝素的步骤，但是通过本专利技术方法制得的PCC制品关键质量指标比如凝血因子活性(≥150S)、凝血酶活性(
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)、肝素含量(≤0.5IU每IU FIX)等关键质量指标均符合中国药典标准。
[0033]3、本专利技术公开方法使得肝素物料损耗进一步降低，节约了生产成本。血液制品企业在生产PCC的过程中，为了应对分离纯化工艺中缓冲液的损耗或突发情况，通常会超理论需求配置生产用缓冲液。CN 106676089 B公开的技术方案在实际生产活动中，通常会超理论体积10％
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备凝血酶原复合物的方法，包括去冷沉淀血浆制备、阴离子交换剂吸附、洗涤、洗脱步骤，其中洗涤步骤使用洗涤液进行洗涤，洗脱步骤使用洗脱液进行洗脱，其特征在于，在所述洗涤液中加入凝血酶抑制剂，所述洗脱液中不加入凝血酶抑制剂；进一步地，所述阴离子交换剂是DEAE Sephadex A50；进一步地，所述洗涤液中加入的凝血酶抑制剂是肝素或抗凝血酶III和肝素的混合物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤液含有不低于0.1IU/g血浆的肝素。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤液含有不低于0.14IU/g血浆的肝素。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤液含有不低于0.18IU/g血浆的肝素。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤液含有不低于0.20IU/g血浆的肝素。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤液含有不低于0.24IU/g血浆的肝素。7.根据权利要求1
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5任一项所述的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：王强，陈海，杨彩兰，郑理，何炫，何海涛，
申请(专利权)人：四川远大蜀阳药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：