抗凝血酶冷冻干燥方法技术

本发明专利技术提供抗凝血酶冷冻干燥方法，所述方法包括将含有抗凝血酶的样品进行预冻、升华干燥和解析干燥三个阶段处理；所述预冻阶段包括至少三次冷冻步骤和至少两次退火步骤，所述冷冻步骤和退火步骤依次交替进行。利用本发明专利技术的方法获得的抗凝血酶冻干制品具有成型好、效价损失率低和均一性高等优点，应用价值高。应用价值高。

【技术实现步骤摘要】
抗凝血酶冷冻干燥方法


[0001]本专利技术涉及生物制药领域，特别涉及抗凝血酶冷冻干燥方法。

技术介绍

[0002]抗凝血酶(antithrombin，AT)是一个较小的蛋白质分子，可灭活凝血系统几种酶类。抗凝血酶是一种由肝产生的糖蛋白，由432个氨基酸组成，包含三个二硫键和四种可能的糖基化位点。其中，抗凝血酶I(AT I)在凝血酶激活纤维蛋白原转化为纤维蛋白后使之附着于新形成的纤维蛋白上(理论上可中和过量凝血酶，缓解血管内凝血)。抗凝血酶II(AT II)是一种血浆中的辅助因子，配合肝素共同作用，干扰凝血酶与纤维蛋白原的相互作用。抗凝血酶IV(AT IV)是一种在凝血过程中和之后短暂时间内被激活的一种抗凝血酶。只有抗凝血酶III(有可能还有凝血酶I)在临床上是有意义的。
[0003]抗凝血酶Ⅲ(AntithrombinⅢ，以下简称“AT
‑Ⅲ”
)既可抑制凝血酶，又可抑制因子IXa、Xa、XIa及其它丝氨酸蛋白酶的凝血作用，是参与生理性凝血机制并控制凝血的首要因子，是血液抗凝血系统中的主要成份，占总抗凝活性的60～70％，其对维持机体正常血液循环，防止血栓发生有重要作用，被临床和血栓与止血学所重视。AT
‑Ⅲ
冻干制品主要是指AT
‑Ⅲ
经血浆分离纯化并与辅料(如稳定剂、结晶赋形剂等)进行冷冻干燥获得的制品，国外从上世纪80年代开始已有上市销售产品，目前被广泛生产和应用。
[0004]然而，抗凝血酶类冻干制品，尤其是AT
‑Ⅲ
冻干制品，其外观非常容易出现萎缩、塌陷或熔化等现象。主要是因为辅料通常需要较低的冷冻干燥温度和更多的动能，使其在冷冻过程完全地结晶，以支持饼状结构。但是，许多冻干工艺的尝试都未能促使辅料完全结晶，这一问题在抗凝血酶Ⅲ的冻干工艺开发中尤为突出。同时，在抗凝血酶的冷冻干燥过程中会将盛装有抗凝血酶和辅料的容器放置在冷冻干燥设备中，由于隔板传导温度，在热传导过程会出现热量损失的情况，故容易出现在冷冻干燥设备的冻干室中部和冻干室外侧位置的冻干制品效果差异大的情况，例如在冷冻干燥设备中部冷冻干燥制得的制品外观呈疏松结晶体、成型较好，而在冷冻干燥设备外侧冷冻干燥制得的制品外观皱缩、成不规则状、成型差。
[0005]因此，目前针对抗凝血酶冷冻干燥方法仍有待研究。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本专利技术提供了抗凝血酶冷冻干燥方法，利用该方法获得的抗凝血酶冻干制品具有成型好、效价损失率低和均一性高等优点，应用价值高。
[0007]需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列工作而完成的：
[0008]目前，冷冻干燥技术通常经过预冻、升华干燥和解析干燥三个阶段，其中预冻阶段通常是将样品直接冷冻至低温并维持直至样品完全冻结和结晶。为此，专利技术人尝试在抗凝血酶预冻阶段增设一步退火步骤，即将样品冷冻至低温后，升高一定温度并维持后，再降低
至低温。在此过程中，专利技术人深入研究发现，抗凝血酶样品的共晶点电阻曲线在升华干燥的升温阶段出现了下降的现象。该现象可能是由两方面的原因造成的：1)预冻阶段没有完全冻结；2)升温阶段升温速率过快，进而导致部分样品熔化。这两种原因均可能会增加抗凝血酶冻干制品水分不合格、外观不符合药典要求等风险的发生概率。专利技术人尝试降低升温速率以优化升温阶段的工艺步骤，但未消除共晶点电阻曲线异常变化的现象。
[0009]进一步地，专利技术人尝试优化预冻阶段的工艺步骤，消除上述现象。与降低预冻温度、延长预冻时间等常规技术手段不同，专利技术人创造性地提出在预冻阶段引入至少两步退火步骤，依据最终冻干制品提高的共晶点和/或共熔点，优化预冻阶段工艺参数，实现冻干样品的所有组分在预冻阶段完全冻结和结晶，进而消除冻干样品在升华干燥的升温阶段共晶点电阻曲线下降的现象。进一步的试验结果表明，预冻阶段包括至少两步退火步骤的冷冻干燥方法制得的抗凝血酶(比如抗凝血酶Ⅲ)冻干制品，水分合格、骨架疏松、外形饱满、无塌陷、无萎缩、无裂纹，冻干制品成型好，外观符合药典要求；效价损失率低，冻干水分含量符合药典要求、批次内或批次间的均匀性高。
[0010]在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种抗凝血酶冷冻干燥方法，所述方法包括：将含有抗凝血酶的样品进行预冻、升华干燥和解析干燥三个阶段处理；所述预冻阶段包括至少三次冷冻步骤和至少两次退火步骤，所述冷冻步骤和退火步骤依次交替进行。
[0011]专利技术人在试验中发现，预冻阶段引入至少两次退火步骤，可有效避免冻干样品在升华干燥的升温阶段共晶点电阻曲线下降的现象发生，降低了由此增加的冻干制品水分不合格、外观不符合药典要求等风险的发生概率，进而确保最终制得的抗凝血酶(比如抗凝血酶Ⅲ)冻干制品水分合格、外观符合药典要求。
[0012]根据本专利技术的实施例，每次所述冷冻步骤的温度各自独立地为﹣60～﹣50℃。由此，有助于冻干样品快速冷冻，并使所有样品组分尽可能完全冻结和结晶。
[0013]根据本专利技术的实施例，每次所述冷冻步骤的降温时间各自独立地为10～20分钟，维持时间各自独立地为300～650分钟。由此，有助于冻干样品尽可能完全冻结和结晶。在本专利技术中，通过限定达到特定温度所用的时间以限定降温/升温速率。所述冷冻步骤的降温速率在确保冻干样品尽可能完全冻结和结晶的同时，可最大限度保留抗凝血酶(比如抗凝血酶Ⅲ)的活性，进而减少冻干制品效价损失，提高冻干制品的品质。
[0014]根据本专利技术的实施例，最后一次所述冷冻步骤的维持时间为550～650分钟，其余各次冷冻步骤的维持时间各自独立地为300～400分钟。由此，在确保冻干样品尽可能完全冻结和结晶的前提下，缩短工艺时长、节约了能源。
[0015]在一些实施例中，从前一个步骤的温度降至本次冷冻步骤的温度的降温时间各自独立地为15分钟。
[0016]根据本专利技术的实施例，每次所述退火步骤的温度各自独立地为﹣30～﹣10℃。所述退火步骤在所述退火温度范围内，冻干样品的共熔点和/或共晶点温度升高，对应升华干燥的升温阶段的共晶点电阻未发生下降现象。
[0017]在一些实施例中，所述预冻阶段包括三次冷冻步骤和两次退火步骤。预冻阶段引入两次退火步骤，在有效避免冻干样品在升华干燥的升温阶段共晶点电阻曲线下降的现象发生的同时，减少了冻干步骤，缩短了工艺时长，节约了能源。
[0018]在一些实施例中，所述第一次退火步骤的温度为﹣12℃～﹣20℃。专利技术人通过研究
发现，在此退火温度下，冻干样品的共熔点温度有效提高。
[0019]在一些实施例中，所述第二次退火步骤的温度为﹣12℃～﹣25℃。专利技术人通过研究发现，在此退火温度下，冻干样品的共熔点温度和/或共晶点温度明显提高。
[0020]在一些实施例中，所述退火步骤的温度各自独立地选自﹣25℃、﹣24℃、﹣23℃、﹣22℃、﹣21℃、﹣20℃、﹣12℃、﹣10℃或﹣10℃。
[0021]根据本专利技术的实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗凝血酶冷冻干燥方法，其特征在于，所述方法包括：将含有抗凝血酶的样品进行预冻、升华干燥和解析干燥三个阶段处理；所述预冻阶段包括至少三次冷冻步骤和至少两次退火步骤，所述冷冻步骤和退火步骤依次交替进行。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每次所述冷冻步骤的温度各自独立地为﹣60～﹣50℃；任选地，每次所述冷冻步骤的降温时间各自独立地为10～20分钟，维持时间各自独立地为300～650分钟；更进一步地，最后一次所述冷冻步骤的维持时间为550～650分钟，其余各次冷冻步骤的维持时间各自独立地为300～400分钟。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每次所述退火步骤的温度各自独立地为﹣30～﹣10℃；进一步地，所述预冻阶段包括三次冷冻步骤和两次退火步骤；任选地，所述第一次退火步骤的温度为﹣12℃～﹣20℃；任选地，所述第二次退火步骤的温度为﹣12℃～﹣25℃；任选地，每次所述退火步骤的升温时间各自独立地为100～150分钟，维持时间各自独立地为100～150分钟。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预冻阶段的初始温度为﹣5～5℃，维持时间为20～40分钟，然后进行冷冻步骤。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述升华干燥阶段包括至少两个升温步骤。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，每次所述升温步骤的温度各自独立地为﹣40～5℃，维持时间为150～2200分钟，真空压力为0.05～0.2mbar；任选地，每次所述升温步骤的升温时间各自独立地为100～150分钟。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述升华干燥阶段包括至少三个升温...

【专利技术属性】
技术研发人员：王超，聂亮，何海涛，王强，钟小梅，
申请(专利权)人：四川远大蜀阳药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：