利用菌糠制备饲用酶的方法技术

本发明专利技术涉及一种用菌糠制备饲用酶的方法。本发明专利技术的技术方案是：以菌糠为培养基，选择绿色木霉对其进行再次发酵，发酵后将菌糠浸提，分离粗酶液，经浓缩、干燥制备干酶粉制剂得到成品。根据本发明专利技术提供的利用菌糠制备饲用酶的方法，较现有的直接从菌糠中分离提取的方法有显著的不同，大大提高了饲用菌的提取率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用菌糠制备饲用酶的方法。
技术介绍
菌糠是指以一定的培养基质栽培食用菌后的废弃培养基。其主要培养基质有棉 籽壳、锯木屑、稻草、玉米芯、甘蔗渣及多种农作物秸秆、工业废料(酒糟、醋糟、造纸厂废液 等)。上述原料因其有效营养物质尤其是粗蛋白质含量极低导致其可饲性能差。但是以这 些原料为培养基栽培食用菌后，通过食用菌菌体的生物固氮作用、酶解作用等一系列生物 转化过程，粗蛋白质、粗脂肪含量均比不经过食用菌发酵前提高二倍以上，纤维素、半纤维 素、木质素和抗营养因子如棉酚等均已被不同程度的降解，同时还产生了多种糖类、有机酸 类和生物活性物质，可作为产酶菌的培养基。饲用酶是一种以酶为主要因子的饲料添加剂，主要包括非淀粉多糖酶、淀粉酶、蛋 白酶、植酸酶、脂肪酶等。其生产主要是利用微生物的发酵。工业上通常采用微生物发酵法 来大规模生产饲用酶制剂。生产工艺包括菌种扩大培养一接种于灭菌原料_发酵-提取、 浓缩、载体吸附_干燥_粉碎_制成粗(浓)酶制剂_分装。发酵主要包括液体发酵和固 体发酵。固体发酵是以麸皮、米糠等为原料，再加入适量的无机盐和水分作为培养基进行的 一种培养。固体发酵设备简单，便于推广，并特别适于霉菌类的培养，但也有一些缺点，如物 料利用不完全、劳动量大、易染菌，而且不适于胞内酶的生产。目前国内多数是利用这类发 酵方法进行酶制剂的生产。菌糠可以用来生产饲用酶，广泛推广运用的品种有纤维素酶、木聚糖酶。张玉明，陆恒在.《饲料研究》，1999，(5) :22 23公开了从菌糠中直接提取饲用 酶的方法。用菌糠生产饲用酶的方法是将菌糠中的饲用酶浸提、浓缩、干燥。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种新的利用菌糠发酵制备饲用酶的方法，以提高菌糠饲用酶 的活性和应用价值。本专利技术的技术方案是以菌糠为培养基，选择绿色木霉对其进行再次发酵，发酵后 将菌糠浸提，分离粗酶液，经浓缩、干燥制备干酶粉制剂得到成品。通常，用一种微生物发酵，不但发酵的菌种，发酵条件对发酵的效果有影响，而且， 发酵的培养基也是至关重要的。即使是用同一种发酵菌和相同的发酵条件，在不同的培养 基中，不一定有必然相同的结果。本申请专利技术人通过研究发现，对废弃的菌糠培养基进行进 一步的二次发酵，可以获得比用原菌糠制备饲用酶的方法更高的酶活。本专利技术选择现有技术中制备饲用酶的绿色木霉作为发酵的菌种。本专利技术还发现，不同的菌糠本身所含酶活力大小和营养物质多少不同，对本专利技术 第二次发酵提供的饲用酶的产率有影响。本专利技术提出优选符合下列条件的菌糠作为原料。 菌糠的CMC酶活应不小于3 (IU/g)，木聚糖酶活不小于2 (IU/g)，蛋白质含量应该不小于4%的菌糠。根据本专利技术的实施例，本专利技术提供的制备方法中，发酵的条件是新鲜菌糠去除 食用菌后打碎，补充加入氮源和碳源，按照ν/W接种3% -6%绿色木霉种子液，在湿度为 50% -70%，温度为26°C -35°C条件下，发酵3_4天。现有技术中已经公开了从菌糠中提取饲用酶的方法。根据本专利技术的实施例，优选在4°C用蒸馏水浸提12h，所得的粗酶液的相对酶活最 高，也就是说酶的提取率最高。根据本专利技术的实施例，所说的浓缩，可以用乙醇沉淀法、硫酸铵沉淀法或者用中空 纤维膜超滤法。优选用中空纤维膜超滤法浓缩饲用酶，大大提高了饲用酶的提取率。根据本专利技术提供的，较现有的直接从菌糠中分离提取 的方法有显著的不同，大大提高了饲用菌的提取率。具体实施例方式实施例1各种菌糠提取粗酶液后，测定样品中酶活力的大小。1材料与方法1.1实验材料1. 1. 1 菌糠香菇菌糠、凤尾菇菌糠、姬菇菌糠、袖珍菇菌糠、金针菇菌糠，从春华食用菌有限公 司获得。1. 2实验方法1.2. 1菌糠中酶活力的测定分别测定香菇菌糠、凤尾菇菌糠、姬菇菌糠、袖珍菇菌糠、金针菇菌糠中的纤维素 酶、木聚糖酶、α-半乳糖苷酶、果胶酶、蛋白酶、植酸酶的活力。1.2. 2酶活力的测定纤维素酶活力测定(DNS法)，木聚糖酶活力的测定(DNS法)，α-半乳糖苷酶活 力的测定(DNS法)，果胶酶活力的测定(DNS法)。2 结果2. 1不同菌糠中酶活力的测定结果见表1。表1不同菌糠中酶活力的比较<table>table see original document page 5</column></row><table>不同菌糠中酶活力的比较见表1，纤维素酶活力以香菇菌糠中的为最高，其次是金 针菇菌糠中的，其它菌糠中的都比较低；木聚糖酶活力以金针菇菌糠中的为最高，其次是香 菇菌糠中的，其它菌糠中的都比较低；α-半乳糖苷酶和果胶酶的活力总体上都比较低。经 比较和分析，香菇菌糠和金针菇菌糠的酶活较高；从纤维素酶活力来看，香菇菌糠的酶活最 高，因此选择香菇菌糠进行后面的试验。实施例2添加微生物菌种绿色木霉Trichoderma viride (CGMCC 3. 3711)发酵对饲用酶活 力的影响1.材料与方法1. 1实验材料1. 1. 1菌糠从春华食用菌有限公司获得。1. 1. 2添加微生物菌绿色木霉对所选菌糠进行发酵。新鲜菌糠去除食用菌后打 碎，加入灭菌后的0. 1% -0. 2%的硫酸铵和-2%的麦麸作为补充氮源和碳源，按照V/ W接种3% -6%的绿色木霉种子液，装入浅盘(3-5厘米高)，在湿度为50% -70%，温度为 26 0C -35 °C条件下，发酵3-4天。1. 2实验方法1. 2. 1菌糠接种微生物菌发酵后，提取粗酶液测定木聚糖酶活和纤维素酶活(CMC 酶活)1. 2. 2蛋白测定凯氏定氮法测定粗蛋白1.2.3纤维素酶活和木聚糖酶活测定采用DNS法测定2、结果2. 1添加微生物菌株对香菇菌糠(菌糠1)、杏鲍菇菌糠(菌糠2)进行发酵，测定 其蛋白含量、CMC酶活和木聚糖酶活。发酵后菌糠中蛋白含量、酶活均有所提高，其中菌糠1 的蛋白含量提高了 66.90%、CMC酶活提高了 88. 1%，木聚糖酶活提高了 62.84%。菌糠2 的蛋白含量提高了 51.35%、CMC酶活提高了 57. 83%，木聚糖酶活提高了 56. 12%。见表2表2绿色木霉对菌糠发酵前后测定CMC酶活和木聚糖酶活 ③将透析袋放入其中，煮沸lOmin。 ④用蒸馏水彻底洗涤。⑤在蒸馏水中煮IOmin。⑥冷却后4°C存放，在贮存过程中透析袋应完全浸于水中。⑦使用前用蒸馏水清洗透析袋内外，操作时用镊子或戴手套。⑧使用时，一端用细绳扎紧，由另一端灌水，用手指稍加压，检查不漏方可装入待 透析液，通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外 的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。1. 2. 2. 2. 3酶液的透析向IL粗酶液中加入固体硫酸铵至80%饱和度，4°C放置过夜，4000r/min离心 20min，收集沉淀，用少量蒸馏水溶解，装入透析袋中，置于4°C冰箱中，用pH4. 8,0. 05mol/L 柠檬酸缓冲液充分透析，每隔3h更换一次透析液，透析12h，得到除盐的酶液，分别测定酶 液中的CMC酶活和木聚糖酶酶活。1.2. 3中空纤维膜过滤法取粗酶液5000ml，选用中空纤维超滤小型试验装置，在0. IMPa下，首先经截留分 子量分别为10000本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用菌糠制备饲用酶的方法，其特征在于以菌糠为培养基，选择绿色木霉对其进行发酵，发酵后将菌糠浸提、分离粗酶液，经浓缩、干燥制备干酶粉制剂得到成品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖兵南，邱美珍，王红兵，刘莹莹，周望平，邹德松，
申请(专利权)人：湖南省畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]